论文摘要
目的：二-（4-氯苯甲酰异羟肟酸）二正丁基合锡（DBDCT）是一种典型的R2SnL2型有机锡类化合物，大量资料表明，此类有机锡化合物可致中枢神经系统损伤，但具体机制不明，有待进一步研究。本实验第一部分拟建立生物样品中锡含量的检测方法，确定DBDCT毒代动力学参数，确定大鼠暴露于毒剂量DBDCT的组织分布，并证明DBDCT可以透过血脑屏障，从而对神经系统产生影响；第二部分及第三部分拟通过动物在体实验和神经细胞体外培养两条途径研究DBDCT引起神经毒性的作用，并对可能机制进行初步探讨。方法：（1）建立原子荧光光谱法（AFS）检测血浆及组织匀浆中锡含量的方法，并采用AFS测定大鼠单次毒剂量（15mg/kg）静脉注射DBDCT后的毒代动力学参数及组织分布，初步判断DBDCT是否可以通过血脑屏障产生神经系统影响；（2）采用紫外分光光度法测定大鼠多次静脉注射DBDCT后的血清及脑组织生化指标；（3）观察大鼠多次静脉注射DBDCT前后体重的变化，并用HE染色检测主要组织脏器的病理学改变，确定主要毒性靶器官和毒性产生的可能原因；（4）通过TUNEL和Westernblot技术，研究大鼠多次静脉注射DBDCT后脑组织凋亡及凋亡相关蛋白的表达情况，初步明确DBDCT产生神经毒性的机制；（5）以PC12细胞为体外神经毒性研究对象，采用MTT法测定染毒后细胞的增殖抑制率，通过光镜、荧光染色和电镜等方法观察细胞核形态的变化，以PI/AnnexinV-FITC双染检测细胞染毒后的凋亡率，DNALadder方法检测细胞染毒后凋亡的特异性条带，用RT-PCR法检测凋亡相关基因的表达情况，从而证实DBDCT通过诱导细胞凋亡产生神经毒性；（6）采用紫外分光光度法测定PC12细胞染毒前后caspase-3和caspase-9活性的变化；以流式细胞术测定线粒体跨膜电位（ΔΨm）及活性氧（ROS）的变化，通过Westernblot分析Bax、Bcl-2、Cyt-c、caspase-3、caspase-9、p-JNK及p-p38等蛋白表达，进一步确证DBDCT通过多个信号转导通路诱导凋亡，产生神经毒性。结果：（1）建立了定量准确，精密度高，操作方便的检测血浆及组织匀浆中锡含量的AFS；测定了大鼠单次毒剂量静脉注射DBDCT后毒代动力学参数：分布半衰期t1/2α为49.977min、消除半衰期t1/2β为1.260min、表观分布容积Vc为8.201（μg/mL）/（mg/kg）、曲线下面积AUC为56.073（mg/kg）min、清除率Cl为0.297μg/mL/min/（mg/kg）；大鼠单次毒剂量静脉注射后DBDCT可迅速分布到各组织，但锡浓度维持时间较短，肾上腺中锡浓度最高，其余组织中锡浓度相似，脑组织中能检测到少量锡元素，注射后两小时内维持0.10μg/g以上水平；（2）大鼠多次静脉注射DBDCT后，血清中AST、ALT、ALP、GGT、STB、BUN及CRE均显著升高（p<0.01），脑组织中SOD及GSH-Px显著降低（p<0.01），而MDA显著增高（p<0.01）；（3）大鼠多次静脉注射DBDCT后，前三周体重虽有增加，但增长缓慢，最后一周称重时体重不增反降，HE染色后光学显微镜下观察发现，染毒组动物肝脏均被膜增厚，部分出现肝细胞嗜酸性变，核固缩等病理改变，部分脑组织也出现神经细胞结节状增生及皮质部分神经细胞变性等病理改变；（4）大鼠多次静脉注射DBDCT后对脑组织进行TUNEL染色，光学显微镜下可见染毒组大鼠大脑皮质中的细胞核大量呈现圆形和不规则形，棕染且着色深，凋亡指数AI极显著增高，从8.26±1.25%增加到30.3±1.94%（p<0.01），Westernblot实验结果显示染毒组蛋白Bax表达增加，蛋白Bcl-2的表达显著减少，Bax/Bcl-2比值从0.767上升至2.842，且蛋白caspase-3及caspase-9均出现显著地剪切条带；（5）MTT法测定DBDCT暴露24h后PC12细胞IC50值为4.110μmol/L，通过光镜、荧光染色和电镜观察到DBDCT染毒后PC12细胞呈现凋亡细胞所特有的形态学特征，PI/AnnexinV-FITC双染显示随DBDCT染毒剂量的增大和暴露时间的延长，PC12细胞的凋亡率显著增加（p<0.05），琼脂糖凝胶电泳中可见凋亡特征性改变的DNA梯形带，RT-PCR实验可见凋亡相关基因caspase-3、caspase-8、caspase-9、NF-κB、Fas、Fas-L及Cty-c的表达均发生显著变化（p<0.05，p<0.01）；（6）PC12细胞暴露于不同染毒剂量DBDCT不同时间后，caspase-3和caspase-9的活性显著增加（p<0.05，p<0.01），随着DBDCT染毒剂量的增加和暴露时间的延长，△Ψm显著下降，ROS的生成明显增多，蛋白Bcl-2的表达下凋，蛋白Bax表达上调，线粒体内蛋白Cyt-c含量显著下降，胞质中蛋白Cyt-c含量明显增加，蛋白caspase-3及caspase-9均出现越来越显著地剪切条带，p-JNK和p-p38的表达逐渐增加，且均有明显量效和时效关系（p<0.01）。结论：（1）AFS适用于测定血液及组织样品中锡的含量，大鼠单次静脉注射DBDCT后血中锡浓度随时间变化符合二室模型，分布迅速，锡浓度维持时间较短，在主要组织器官中不易蓄积，DBDCT可以透过血脑屏障，因此可能对神经系统产生影响；（2）DBDCT影响大鼠体重增长和一般生长发育，改变大鼠血清中多种生化指标，表现出显著地肝脏及肾脏毒性；（3）DBDCT降低大鼠脑组织中抗氧化系统的活性，增强脑组织脂质过氧化反应，一定程度上通过诱导细胞凋亡对大鼠脑组织神经系统造成损害；（4）DBDCT能够诱导体外培养的PC12细胞株发生凋亡，作用机制可能是氧化应激及DNA损伤；Bcl-2家族、线粒体凋亡途径及MAPK信号转导通路均参与到DBDCT诱导的PC12细胞凋亡中，揭示DBDCT通过多途径诱导神经细胞凋亡从而产生神经毒性。