抗S. paratyphi A O2抗原单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立

论文摘要

伤寒副伤寒是由伤寒杆菌（Salmonella typhi）和副伤寒杆菌甲、乙、丙（S.paratyphiA,B,C）引起的急性肠道传染病,在全球分布很广,估计每年伤寒发病1600万～1700万,死亡60万,主要在发展中国家。以前我国伤寒发病占伤寒副伤寒总发病的90%以上,后来由于伤寒Vi疫苗的广泛使用,20世纪90年代中期,流行菌株发生转变,我国部分省份伤寒病例逐渐下降,而由甲型副伤寒沙门氏菌引起的副伤寒病例却大幅上升,并呈现由散发到局部暴发,由沿海省份向内地省份推进的流行趋势,近几年来成为我国一些地区传染病突发事件的主要病种,常发展成重大疫情,急需建立快速、准确的诊断方法。实验室常规检测、诊断甲型副伤寒的主要方法为细菌培养、肥达氏凝集反应和伤寒血球快速诊断。这些方法费时费力,不利于早期诊断,给流行病学专家在追踪传染源、早期控制与临床医生早期诊断工作带来了一定的难度。以酶联免疫吸附试验为原理建立起来的各种免疫学检测方法,特异性好、灵敏度高、操作简便、样品处理量大,已经广泛应用于临床和食品中病原菌的检测。但是目前国内外还很少有用ELISA方法检测甲型副伤寒沙门氏菌的报道,本研究中,我们先制备抗甲型副伤寒沙门氏菌O2抗原的单克隆抗体和多克隆抗体,然后以此为基础建立夹心ELISA方法,快速检测该菌。1.甲型副伤寒沙门氏菌单克隆抗体的制备与鉴定甲型副伤寒沙门氏菌的菌体抗原包括O1、O2和O12三种,其中O2抗原为该菌所特有。我们选用甲型副伤寒沙门氏菌模式菌株50001,经沸水浴2h后制备菌体抗原,免疫5只6-8周龄雌性Balb/C小鼠,经过11次细胞融合筛选出两株分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,2C6和4F10,其腹水效价分别为1:25600和1:12800,通过SDS-PAGE分析,两株杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体分子量均在180KD左右。2C6和4F10分泌的单克隆抗体不与伤寒等其它细菌发生交叉反应,为特异性针对甲型副伤寒沙门氏菌02抗原的抗体。2.夹心ELISA检测方法的建立用相同抗原免疫兔子,制备多克隆抗体,选用单抗2C6和HRP标记的羊抗鼠酶标二抗,建立检测甲型副伤寒沙门氏菌双抗夹心ELISA方法。实验结果表明,此ELISA方法不与属内外常见致病菌发生交叉反应,特异性较好;检测限达到105CFU/mL,灵敏度高;整个检测过程4-5h即可完成,为食品检验以及临床医生早期诊断提供一种快速、灵敏、有效的方法。通过以上研究工作,初步确定了甲型副伤寒沙门氏菌的夹心ELISA检测程序并优化了反应条件。其方法的稳定性和实际应用情况还有待进一步完善,以便为试剂盒的研制打下基础。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1.1 沙门氏菌的特征与流行现状
• 1.1.1 沙门氏菌的特征
• 1.1.2 沙门氏菌的流行现状
• 1.2 沙门氏菌检测方法研究现状
• 1.2.1 常规检测技术
• 1.2.1.1 前增菌
• 1.2.1.2 选择性增菌
• 1.2.1.3 选择性平板分离
• 1.2.1.4 生化试验
• 1.2.1.5 血清学分型
• 1.2.2 以免疫学为基础的检测方法
• 1.2.2.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 1.2.2.2 免疫磁珠法（Immunomagnetic bead,IMB）
• 1.2.2.3 SPA协同凝集试验（Coagglutination assay,COA）
• 1.2.2.4 乳胶凝集试验（Latex agglutination test,LAT）
• 1.2.2.5 胶体金
• 1.2.2.6 免疫荧光法（Immunofluoresent assay,FA）
• 1.2.3 分子生物学方法
• 1.2.3.1 普通PCR（Polymerase Chain Reaction）
• 1.2.3.2 多重PCR（Multiplex PCR,MPCR）
• 1.2.3.3 实时荧光定量PCR（Realtime-PCR,RT-PCR）
• 1.2.3.4 基因芯片技术
• 1.2.4 化学组分分析法
• 1.2.4.1 GC-MS-FAME（Gas Chromatography-Fatty Acid Methyl esters）
• 1.2.4.2 Py-GC-MS（Pyrolysis-Gas Chromatography-mass spectrum）
• 1.2.5 仪器法
• 1.2.5.1 API
• 1.2.5.2 VITEK
• 1.2.5.3 mini-VIDAS
• 1.3 S.paratyphi A流行与研究现状
• 1.3.1 S.paratyphi A流行现状
• 1.3.2 S.paratyphi A研究现状
• 1.4 本研究的目的意义
• 第二章 抗S.paratyphi A O2抗原单克隆抗体制备
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 菌株、细胞、动物
• 2.2.1.2 培养基及主要试剂
• 2.2.1.3 引物设计
• 2.2.1.4 培养基及主要试剂配制
• 2.2.1.5 间接ELISA试剂配制
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 菌株活化与鉴定
• 2.2.2.2 抗原制备
• 2.2.2.3 小鼠免疫
• 2.2.2.4 筛选方法建立
• 2.2.2.5 SP2/0骨髓瘤细胞的复苏、培养和处理
• 2.2.2.6 饲养细胞制备
• 2.2.2.7 SP2/0骨髓瘤细胞的制备
• 2.2.2.8 免疫脾细胞悬液制备
• 2.2.2.9 细胞融合
• 2.2.2.10 间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清
• 2.2.2.11 杂交瘤细胞的克隆化（有限稀释法）
• 2.2.2.12 杂交瘤细胞冻存
• 2.2.2.13 单克隆抗体的大量制备和效价测定
• 2.2.2.14 单克隆抗体纯化
• 2.2.2.15 单克隆抗体特异性测定
• 2.2.2.16 SDS-PAGE测分子量
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 菌株鉴定
• 2.3.1.1 S.paratyphi A的形态
• 2.3.1.2 S.paratyphi A PCR鉴定结果
• 2.3.2 免疫小鼠抗体效价测定
• 2.3.4 方正滴定确定筛选方法
• 2.3.5 细胞融合与阳性杂交瘤细胞筛选
• 2.3.6 杂交瘤细胞克隆化培养与细胞系建立
• 2.3.7 单克隆抗体生产和效价测定
• 2.3.8 各杂交瘤细胞单克隆抗体特异性
• 2.3.9 McAb分子量测定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 免疫用抗原
• 2.4.2 动物免疫
• 2.4.3 污染与控制
• 2.4.4 细胞融合
• 2.4.5 杂交瘤细胞的筛选
• 2.4.6 杂交瘤细胞的亚克隆
• 2.4.7 杂交瘤细胞的冻存与复苏
• 2.5 小结
• 第三章 S.paratyphi A夹心ELISA检测方法建立
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 实验动物
• 3.2.1.2 实验菌株
• 3.2.2 方法
• 3.2.2.1 兔多克隆抗体制备
• 3.2.2.2 多抗纯化及效价测定
• 3.2.2.3 夹心ELISA方法建立
• 3.2.2.4 抗原制备方法
• 3.2.2.5 封闭液和封闭时间选择
• 3.2.2.6 抗原吸附时间
• 3.2.2.7 单抗和酶标二抗反应时间
• 3.2.2.8 底物显色时间
• 3.2.2.9 夹心ELISA特异性的确定
• 3.2.2.10 夹心ELISA检测限的确定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 兔多克隆抗体制备及其效价测定
• 3.3.2 夹心ELISA方法建立
• 3.3.3 抗原制备方法
• 3.3.4 封闭液和封闭时间选择
• 3.3.5 抗原反应时间
• 3.3.6 抗体作用时间
• 3.3.7 确定底物显色时间
• 3.4.8 夹心ELISA特异性的确定
• 3.3.9 夹心ELISA检测限的确定
• 3.4 讨论
• 3.4.1 抗体的选择
• 3.4.2 抗体工作浓度的选择
• 3.4.3 反应时间的选择
• 3.4.4 操作的影响
• 3.5 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录