半胱胺、胱氨酸和卵丘细胞在提高山羊裸卵GSH水平及发育能力中的作用

论文摘要

体外成熟（IVM）之前脱去卵丘细胞会严重损伤卵母细胞的胚胎发育能力和谷胱甘肽（GSH）合成的能力。裸卵（DOs）体外成熟质量的低下严重限制了诸如生发泡（GV）移植,体细胞单倍体化以及GV期卵母细胞冷冻保存等胚胎工程技术的发展。目前研究人员所应用的多种DOs体外成熟系统都只能部分改善其发育潜能。此外,我们目前对卵丘细胞促进卵母细胞成熟质量的机制还知之甚少。因此,建立一种完善的DOs体外成熟系统具有非常重要的应用价值和理论意义。在本实验中,我们以山羊为实验动物,比较了不同形式的卵丘细胞（分散的卵丘细胞、卵丘细胞单层以及卵丘卵母细胞复合体）共培养对山羊DOs胚胎发育能力的影响,卵丘细胞单层培养过程中培养液中添加激素成分（FSH、LH、17β-E2）对卵丘细胞黄体化的抑制作用,此外还详细研究了半胱胺、胱氨酸以及卵丘细胞之间相互作用对山羊裸卵体外成熟后胞质中GSH水平以及发育能力的影响,以期建立一种高效完善的DOs体外成熟系统并对卵丘细胞促进卵母细胞成熟机制进行深入探讨。实验结果表明:1、山羊DOs的体外成熟率和孤雌激活后的胚胎发育能力都显著低于卵丘卵母细胞复合体（COCs）（p<0.05）,各种形式的卵丘细胞均能显著提高裸卵的体外成熟率以及胚胎发育到桑椹胚的能力（p<0.05）,但对其囊胚发育率并没有明显的改善（p>0.05）。与分散的卵丘细胞（DCCs）和COCs相比,卵丘细胞单层对于裸卵桑椹胚率的提高更明显。2、卵丘细胞单层培养过程中,当培养液中含有激素成分（FSH、LH、17β-E2）时,培养5天后其中的孕酮的含量与无细胞的对照组培养液差异不显著（p>0.05）,当不添加激素时卵丘细胞向培养液中释放的孕酮量大大增加（p<0.05）。说明培养过程中激素的存在能够显著抑制卵丘细胞的黄体化。3、成熟培养液中添加半胱胺能够浓度依赖性的提高COCs胞质中的GSH水平。当半胱胺浓度为100μM时,孤雌激活后囊胚发育率最高,随着半胱胺浓度进一步升高,囊胚率反而下降,囊胚细胞数的变化趋势也与之类似。4、成熟培养液中添加胱氨酸能够浓度依赖性的提高COCs胞质中的GSH水平,当胱氨酸浓度为200μM时,孤雌激活后囊胚发育率最高,随着胱氨酸浓度进一步升高,囊胚率反而下降,囊胚细胞数的变化趋势也与之类似。5、向培养液中同时添加半胱胺（100μM）和胱氨酸（200μM）能够使山羊COCs的囊胚发育率明显提高（p<0.05）,但是对成熟后胞质中的GSH水平并没有进一步的影响（p>0.05）。增加半胱胺和胱氨酸的含量（200μM and 500μM respectively）并没有继续提高山羊COCs的囊胚发育能力和胞质中GSH水平。6、山羊裸卵的体外成熟、胞质中GSH合成能力以及胚胎发育能力都显著低于COCs（p<0.05）,向成熟培养液TCM-199中添加半胱胺能够显著提高山羊DOs的以上指标,但是添加胱氨酸对DOs的体外成熟,胚胎发育和GSH合成情况都没有任何改善。与单独添加半胱胺相比,同时添加时半胱胺和胱氨酸则能够明显改善山羊DOs的体外成熟,囊胚发育以及GSH合成能力（p<0.05）。说明山羊裸卵本身能够利用培养液中的半胱胺,但不能利用培养液中的胱氨酸,半胱胺能够促进山羊裸卵对胱氨酸的利用。7、在卵丘细胞单层存在的情况下,向成熟培养液中单独添加半胱胺或者胱氨酸都能明显改善山羊DOs的囊胚发育以及GSH合成能力,当二者同时存在时囊胚发育情况得到进一步提高（p<0.05）,囊胚细胞数也较单独添加巯基物质时明显增多（p<0.05）,达到与不添加任何巯基物质时COCs类似的水平,但胞质GSH水平并没有得到进一步的提高。因此本实验首次建立了能够使山羊裸卵发育潜能完全恢复的体外成熟系统。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 卵母细胞成熟
• 1.1.1 卵母细胞核成熟与胞质成熟
• 1.1.2 卵母细胞胞质成熟质量判定标准
• 1.1.2.1 成熟卵母细胞形态学检测和亚细胞结构检测
• 1.1.2.2 体外胚胎发育
• 1.1.2.3 胞质中谷胱甘肽（GSH）含量
• 1.1.3 裸卵的体外成熟
• 1.1.3.1 裸卵体外成熟的重要意义
• 1.1.3.2 卵丘细胞在卵母细胞成熟过程中的作用
• 1.1.3.3 裸卵体外成熟系统的研究进展
• 1.2 卵母细胞GSH 合成
• 1.2.1 细胞中的谷胱甘肽
• 1.2.1.1 细胞内 GSH 的合成
• 1.2.1.2 细胞内GSH 的代谢
• 1.2.1.3 GSH 的主要生化作用
• 1.2.1.4 GSH 在卵母细胞成熟和受精过程中的作用
• 1.2.2 细胞内GSH 含量检测
• 1.2.2.1 分光光度法
• 1.2.2.2 谷胱甘肽还原酶循环法（GR-DTNB）
• 1.2.2.3 荧光法
• 1.2.2.4 和分离手段结合的检测方法
• 1.2.2.5 其它方法
• 1.2.3 半胱胺和胱氨酸在促进卵母细胞GSH 合成作用
• 1.2.3.1 半胱胺和胱氨酸在提高卵母细胞成熟质量方面的应用
• 1.2.3.2 成熟培养液中添加半胱胺和胱氨酸对裸卵体外成熟的影响
• 1.2.3.3 半胱胺和胱氨酸促进GSH 合成机制
• 1.2.4 论文研究的主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 山羊卵母细胞获取
• 2.2 山羊卵母细胞体外成熟
• 2.3 山羊卵丘细胞单层的制备
• 2.4 山羊卵丘细胞分泌孕酮能力检测
• 2.5 山羊卵丘细胞与卵母细胞共培养
• 2.5.1 卵丘细胞单层与卵母细胞共培养
• 2.5.2 分散的卵丘细胞以及COCs 与卵母细胞共培养
• 2.5.3 山羊COCs 与裸卵共培养
• 2.6 山羊卵母细胞孤雌激活
• 2.7 胚胎培养
• 2.8 胚胎观察以及囊胚细胞计数
• 2.9 山羊卵母细胞胞质中谷胱甘肽（GSH）含量的检测
• 2.10 实验结果统计及数据分析
• 3 结果
• 3.1 山羊裸卵（DOS）共培养系统的建立
• 3.1.1 不同形式的卵丘细胞对山羊DOs 体外成熟以及胚胎发育能力的影响
• 3.1.2 培养液中激素成分对山羊卵丘细胞黄体化的影响
• 3.2 促进山羊卵母细胞胚胎发育能力和GSH 合成所需半胱胺最佳浓度的筛选
• 3.3 促进山羊卵母细胞胚胎发育能力和GSH 合成所需胱氨酸最佳浓度的筛选
• 3.4 半胱胺和胱氨酸同时存在对山羊COCS 胚胎发育能力以及GSH 合成的影响
• 3.4.1 单独或者同时添加半胱胺和胱氨酸对山羊COCs胚胎发育能力以及GSH 合成的影响
• 3.4.2 同时添加高浓度的半胱胺和胱氨酸对山羊COCs 胚胎发育能力以及胞质中GSH 水平的影响
• 3.5 单独或者同时添加半胱胺和胱氨酸对山羊裸卵（DOS）胚胎发育能力以及GSH 合成的影响
• 3.6 半胱胺、胱氨酸以及卵丘细胞之间相互作用对山羊裸卵DOS)胚胎发育能力以及胞质中GSH 含量的影响
• 4 讨论
• 4.1 山羊裸卵共培养系统的建立
• 4.2 成熟培养液中添加半胱胺和胱氨酸对山羊卵丘卵母细胞复合体影响
• 4.3 半胱胺、胱氨酸以及卵丘细胞之间的相互作用对山羊裸卵的影响
• 5 结论
• 6 参考文献
• 图版
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况