论文题目: 猪Endoglin DNA疫苗诱导抗肿瘤血管生成机理研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 外科学
作者: 焦解歌
导师: 张阳德
关键词: 肿瘤血管生成,疫苗,主动免疫基因治疗
文献来源: 中南大学
发表年度: 2005
论文摘要: 背景 恶性肿瘤是导致人类死亡的主要原因之一。目前以手术、化疗和放疗为基本模式的肿瘤治疗尚未达到预期的效果,恶性肿瘤病人5年生存率还没有超过10%。因此,寻求其它更加有效的治疗手段或方法仍是肿瘤临床研究的主要任务之一。目前,肿瘤免疫生物治疗(尤其是肿瘤主动免疫治疗)是肿瘤治疗研究的新热点,有可能克服传统化疗和放疗的严重合并症。但是,由于大多数肿瘤尚没有发现有特异的抗原存在,因此,以肿瘤细胞为靶向的免疫生物治疗研究前景受到了一定的影响。越来越多的证据表明,实体肿瘤的生长和转移必须依赖肿瘤血管生成(Angiogenesis),各种实体肿瘤血管在生成过程中血管内皮细胞所表达的生长因子及其受体均有共性,针对这些生长因子或者受体的抗肿瘤血管生成治疗策略将有可能应用于各种实体肿瘤的治疗,以这些生长因子受体为靶点的抗肿瘤血管生成主动免疫基因治疗显现了良好的应用前景。可是,由于机体对自身分子,包括对与血管发生发展相关的生长因子受体分子存在免疫耐受,难以诱导有效的免疫反应。当前,国内外已经有多项研究表明,采用异种同源分子的DNA疫苗可以诱导机体产生针对自身同源相应分子的交叉免疫反应,从而打破对自身分子的免疫耐受。在本研究中,作者选择了与肿瘤血管生成密切相关的Endoglin作为模型分子,用猪Endoglin DNA分子作为小
论文目录:
前言
附：研究技术路线
第一章：猪和小鼠Endoglin胞外段基因的克隆扩增、真核表达载体的构建及鉴定
1 材料
1.1 质粒与菌株
1.2 细菌培养基
1.3 工具酶
1.4 提取总RNA试剂及RT-PCR试剂盒及相关试剂
1.5 胶回收试剂盒及小量质粒回收试剂盒
1.6 琼脂糖凝胶电泳缓冲液
1.7 仪器设备
2 方法
2.1 引物的设计与合成
2.2 猪和小鼠胚肝总RNA的提取
2.3 RT-PCR扩增猪Endoglin胞外段cDNA
2.4 RT-PCR扩增小鼠Endoglin胞外段cDNA
2.5 cDNA片段的回收
2.6 感受态细胞的制备
2.7 质粒的小量提取
2.8 质粒转化大肠杆菌感受态细胞
2.9 内切酶酶切和连接反应
2.10 猪Endoglin真核表达质粒的构建
2.11 重组猪Endoglin真核表达质粒的鉴定
2.12 小鼠Endoglin真核表达质粒的构建
2.13 鼠重组endoglin真核表达质粒的鉴定
3 结果
3.1 猪Endoglin胞外段基因克隆及真核表达载体的鉴定
3.2 小鼠Endoglin胞外段真核表达质粒的构建与鉴定
4 讨论
第二章：猪和小鼠Endolgin胞外段真核表达载体体外真核表达鉴定
1 材料
1.1 细胞株
1.2 细胞培养基
1.3 主要试剂盒和生化试剂
1.4 主要仪器设备
2 方法
2.1 各种溶液的配制方法
2.2 COS-1细胞培养
2.3 重组质粒的大量制备和纯化
2.4 重组质粒ppEDG和pmEDG体外转染COS-1细胞
2.5 总RNA提取
2.6 RT-PCR
2.7 免疫印迹(Western blot)分析
3 结果
3.1 重组质粒真核表达的RT-PCR鉴定
3.2 重组质粒真核表达的Western blot鉴定
4 讨论
第三章：猪Endoigin胞外段真核表达质粒DNA疫苗抗肿瘤效果观察
1 材料
1.1 肿瘤细胞系
1.2 细胞培养基
1.3 主要试剂盒及生化试剂
1.4 实验动物
1.5 主要仪器设备
2 方法
2.1 肿瘤细胞培养
2.2 建立肿瘤动物模型
2.3 疫苗免疫毒副作用观察
2.4 统计学分析
3 结果
3.1 肿瘤保护性免疫效果观察
3.2 肿瘤治疗性免疫效果观察
3.3 抗小鼠肿瘤转移效果观察
3.4 毒副反应的观察
4 讨论
第四章：猪Endolgin胞外段真核表达质粒DNA疫苗抗肿瘤作用机理研究
1 材料
1.1 肿瘤细胞系
1.2 细胞培养基
1.3 主要试剂盒及生化试剂
1.4 实验动物
1.5 主要仪器设备
2 方法
2.1 肿瘤细胞培养
2.2 肿瘤组织标本及血清的获取
2.3 溶液的配制方法
2.4 ELISA检测免疫小鼠血清中抗体滴度
2.5 Enzyme-linked immunospot(ELISPOT)assay
2.6 脾细胞悬液的制备
2.7 免疫印迹(Western blot)分析
2.8 免疫球蛋白亚型测定
2.9 血清免疫球蛋白的纯化
2.10 清免疫球蛋白过继免疫治疗
2.11 肿瘤组织内微血管免疫组化染色
2.12 藻酸盐包裹实验观察肿瘤血管生成情况
2.13 统计学分析
3 结果
3.1 ELISA检测血清中抗猪和抗小鼠Endoglin抗体
3.2 Western blot检测血清中抗猪和小鼠Endoglin抗体
3.3 ELISPOT检测脾脏中分泌抗猪和小鼠Endoglin抗体的B淋巴细胞
3.4 抗Endoglin分子的自身抗体抑制肿瘤生长
3.5 免疫荧光检测肿瘤组织中抗自身抗体沉积
3.6 自身免疫球蛋白过继被动免疫治疗
3.7 抗Endoglin分子的自身抗体抑制肿瘤血管生成
4 讨论
结论
综述：Endoglin与肿瘤血管生成治疗研究进展
1.Endoglin的结构与功能
2.Endoglin的组织表达
3.Endoglin与血管生成和血管发育
4.Endoglin S亚型的临床应用
5.Endoglin与肿瘤的诊断和预后
6.以Endoglin为靶标的抗血管生成治疗
7.结论与展望
参考文献
致谢
攻读学位期间主要的研究成果
发布时间: 2006-03-28
参考文献
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