水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani AG1 IA Fosmid基因组文库的构建及线粒体全基因组组装分析

论文摘要

水稻纹枯病菌是世界性的水稻重要病害,同时也是我国水稻三大病害之一。目前其基因组研究较少,限制了许多研究工作的开展。本研究构建了第一个稻立枯丝核菌丝AG1 IA fosmid基因文库。利用Illumina GAⅡ技术对水稻立枯丝核菌AG1 IA的基因组DNA以及线粒体DNA（mtDNA）进行测序,并对mtDNA的测序结果进行拼接,得到一个完整的线粒体基因组序列,对其上的基因进行组装,预测,并对物种间线粒体基因的进化特点和系统演化进行分析。主要结果如下：1、水稻纹枯病AG1 IA Fosmid基因组文库的构建和鉴定本研究在构建之前已经在进行水稻丝核菌AG1 IA全基因组测序,基因组大小为36.4Mb。从水稻立枯丝核菌AG1 IA提取基因组DNA,选取大小合适的DNA片段用低熔点琼脂糖回收,后进行末端修饰,再以Fosmid质粒作为载体,构建了水稻立枯丝核菌AG1 IA fosmid基因组文库。该文库包含有5000个克隆,重组率为100%；随机挑去16个克隆进行培养、NotI酶切、脉冲电泳检测插入片段长度分布在35-45kb之间,平均为35kb,覆盖率为水稻立枯丝核菌丝AG1 IA基因组的4.81倍,从文库中筛选得到单拷贝DNA序列的概率为97%。从16个单克隆中挑去8个克隆进行末端测序,其中一个未测出,对末端进行比对,均为菌类相关序列。水稻立枯丝核菌AG1 IA fosmid基因组文库的构建,为今后该物种基因组的研究工作奠定了基础,为开展分子标记发掘、功能基因筛选与定位、遗传图谱、物理图谱的构建等研究工作提供了有效的工具。2.水稻纹枯病AG1 IA mtDNA的提取以及拼接组装。1)利用常规碱裂解法（SDS法）方法加酶解法（DNAse）,超速离心分离得到了水稻纹枯病AG1 IA的mtDNA;2)在NT Database数据库Blast比对鉴定线粒体基因。用SOAPdenovo软件拼接组装线粒体基因,得到一个有28个缺口、全长146kb的线粒体基因组,根据每个缺口上游端和下游端已知的序列设计引物进行PCR扩增填补。最终,我们得到一个全长146,118bp的线粒体全基因组序列。3.水稻纹枯病AG1 IA mtDNA的分析我们获得了21个与线粒体基因非常相似的开放阅读框（ORFs）。找到了线粒体上一些非常保守的基因如：COX1、COX2、ATP6。在整个预测过程中,利用BLASTX从Swiss-Prot database数据库鉴定候选同源基因。用exonerate多序列比对软件对氨基酸序列进行分析,在Swiss-Prot proteins数据库对这些序列进行比对得到这些有用的开放阅读框（ORFs）。从已知的DNA序列中,我们通过Rfam v9.1鉴定出了1个tRNA基因,1个核糖体RNA基因、4个核酶基因,使用tRNAscan-SE鉴定出了另外25个tRNA基因。1)全序列以及结构分析：通过线粒体测序,得到其全基因组全长为146,118kb, GC含量为33.8%。包含26个tRNA基因、15个蛋白质编码基因、1个核糖体基因、4个核酶基因。2) tRNA组成以及二级结构分析：水稻立枯丝核菌丝AG1 IA mtDNA包含26个tRNA基因,tRNA-Thr和tRNA-Arg各有2个,tRNA-Met是3个,还有两个不知功能的tRNA-Undet.其他17种氨基酸都只有一个tRNA,绘制了各种tRNA基因的二级结构。3)蛋白质编码基因的分析：预测共编码有21种蛋白质多肽,包括21个蛋白基因（ATP6、ATP8、ND1、ND3、ND4、ND5、ND6、ND6、COX1、COX2、COX3、Cytb、Cyb、BI1、BI1、BI2、IAmt2、IAmt6、IAmt7、IAmt8、IAmt18）3.水稻立枯丝核菌AG1 IA线粒体基因组进化分析。对AG1 IA的线粒体ATP6基因和（?）Cytb基因以及从NCBI/GenBank中各真菌的对应基因进行同源性比对,构建了ATP 6基因和Cytb基因的系统进化树,为水稻丝核菌的分类鉴定提供参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 0. 引言
• 1.1 水稻纹枯病生物学特征
• 1.1.1 水稻纹枯病菌丝融合群鉴定
• 1.1.2 水稻纹枯病特征
• 1.1.3 病原菌生长条件
• 1.2 大片段基因组文库的发展
• 1.2.1 噬菌体文库
• 1.2.2 黏粒文库
• 1.2.3 人工染色体文库
• 1.2.4 其它的大片段文库
• 1.3 大片段基因组文库的应用
• 1.3.1 物理作图
• 1.3.2 基因组测序
• 1.3.3 图位克隆
• 1.3.4 分子标记的发掘
• 1.3.5 基因的染色体定位
• 1.4 线粒体基因组研究意义
• 1.4.1 线粒体基因是细胞内相对独立的基因组
• 1.4.2 线粒体DNA多态性是很好的进化研究分析标记
• 1.4.3 线粒体基因的主要编码功能
• 1.4.4 线粒体基因与核基因之间的联系
• 1.5 线粒体基因组研究进展
• 1.5.1 线粒体基因组多样性研究
• 1.5.2 线粒体基因结构研究
• 1.6 本研究的目的意义
• 第二章 水稻纹枯病菌RHIZOCTONIA SOLANI AG1 IA FOSMID基因组文库的构建和鉴定
• 第一节 水稻立纹枯病菌RHIZOCTONIA SOLANI AG1 IA FOSMID基因组文库的构建
• 0 引言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 菌丝的显微观察
• 2.2.2 菌丝之间的融合鉴定（主要是AG1 IA、AG1 IB、AG1 IC之间的鉴定）
• 2.2.3 基因组DNA的制备
• 2.2.4 适合片段的回收与末端修复
• 2.2.5 链接、包装与转染
• 2.2.6 克隆保存
• 2.3 讨论
• 第二节 水稻纹枯病RHIZOCTONIA SOLANI AG1 IA FOSMID基因组文库的质量鉴定
• 0. 引言
• 2.4 材料与方法
• 2.4.1 水稻纹枯病AG1 IA基因组含量的测定
• 2.4.2 插入片段大小的检测
• 2.4.3 末端测序
• 2.5 结果与分析
• 2.5.1 水稻纹枯病AG1 IA基因组大小
• 2.5.2 NotⅠ酶检测切插入片段
• 2.5.3 文库覆盖率的计算
• 2.5.4 对插入片段的末端测序
• 2.5.5 随机抽取6个克隆片段,进行全序列测序
• 2.6 FOSMID与基因组测序SCAFFOLD序列对比
• 2.7 讨论
• 2.7.1 Fosmid文库的质量鉴定
• 2.7.2 关于Fosmid文库的构建效率
• 2.7.3 Fosmid文库构建的意义
• 第三章 水稻纹枯病菌AG1 IA线粒体基因组装分析
• 0. 引言
• 3.1 主要设备和试剂
• 3.1.1 主要仪器设备
• 3.1.2 主要试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 材料准备
• 3.2.2 提取方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 线粒体DNA的提取及检测
• 3.3.2 对测序过程中出现的漏洞进行补洞
• 3.3.3 线粒体基因的获得
• 3.4 讨论
• 第四章 水稻纹枯病菌AG1 IA线粒体基因组全序列分析
• 4.1 线粒体基因的组成成分分析
• 4.2 线粒体基因组中各类基因的分析
• 4.2.1 tRNA的组成及二级结构分析
• 4.2.2 线粒体蛋白质编码基因分析
• 4.3 线粒体基因的进化分析
• 4.3.1 根据Atp6基因的氨基酸序列的同源性构建系统发育树
• 4.3.2 根据Cytb编码的氨基酸序列同源性构建系统发育树
• 4.4 本章小结
• 第五章 主要结论和后期开展
• 5.1 主要结论
• 5.2 后期开展
• 参考文献
• 致谢
• 附件