生物降解菌株Delftia tsuruhatensis AD9中染色体编码的苯胺代谢基因簇的克隆和功能研究

论文题目: 生物降解菌株Delftia tsuruhatensis AD9中染色体编码的苯胺代谢基因簇的克隆和功能研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 梁泉峰

导师: 林敏

关键词: 苯胺,生物降解,基因簇

文献来源: 中国农业科学院

发表年度: 2005

论文摘要: 从印染厂活性污泥中分离到的一株能高效降解苯胺的细菌菌株AD9,其最高耐受苯胺浓度为4500mg/l,在18小时内将起始浓度为1000mg/l的苯胺完全降解。经传统菌株表型比较、16SrDNA序列同源性比对（GenBank登录号:AY89912）、GC含量测定以及标准菌株DNA-DNA杂交分析,将该菌鉴定为Delftia tsuruhatensis AD9。采用脉冲场电泳和Southern杂交实验结果表明,AD9的苯胺降解基因簇位于染色体上。本工作有关Delftia tsuruhatensis的苯胺降解能力以及苯胺代谢基因簇的染色体定位特征研究属首次报道。 利用苯胺不完全降解时中间产物的显色反应如当邻苯二酚（Catechol）代谢被阻断时,邻苯二酚累积后自身氧化成棕色;和2-羟粘康酸半醛（HMS）代谢被阻断或邻苯二酚双加氧酶过量表达时,因HMS累积而呈现金黄色,建立了简便快速的苯胺代谢途径相关基因的功能筛选方法。从构建的AD9的基因文库中筛选得到三个阳性克隆,分别为含9.3kb HindⅢ插入片段的棕色阳性克隆pDA1、含大小为15.4kb的HindⅢ插入片段的金黄色阳性克隆pDBⅡ和含8.2kb EcoRⅠ插入片段的金黄色阳性克隆pDB2。Clark-type电极测定重组子pDA1的苯胺双加氧酶酶活为32±3mg O2/（g dry、Wt）.h;内源呼吸16±2 mg O2/（g dry Wt）.h。pDA1在含苯胺的LB液体培养基上培养24小时后,GC/MS分析产物的化学性质:主要的特征离子在m/z 92（M+-H2O）,81（M+-CHO）,64（M+-H2O,-CO）,与邻苯二酚标准品的结果完全一致。比色法测定重组子pDB2的邻苯二酚2,3双加氧酶（C23O）酶活为3.2 units/mg protein。 对三个阳性克隆pDA1、pDB2和 pDB11进行核苷酸序列分析,经拼接获得一段大小为24.7kb的序列（GenBank登录号AY940090）,包含25个开放阅读框,其中至少含有17个与苯胺代谢有关的基因,命名为tad QTA1A2BRD1C1D2C2EFGIJKL。基因簇两侧含转座酶和IS1071序列。调控基因tadR编码赖氨酸型调控蛋白。tadQTA1A2B基因簇的表达由一个启动子控制,编码多组分的苯胺双加氧酶。tadD1C1D2C2EFGIJKL基因簇的表达由一个启动子控制,编码参与邻苯二酚间位裂解途径所有的酶系,其中tadD1和tadD2编码的两组植物型铁氧化还原蛋白,tadC1和tadC2编码的两组邻苯二酚双加氧酶,功能是催化邻苯二酚的开环反应。余下的tadEFGIJKL基因簇编码2-羟粘康酸半醛脱氢酶（HMSD）、水解酶（HMSH）、2-酮-4-烯戊酸水解酶（OEH）、乙醛脱氢酶（ADA）、4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶（HOA）、4-草酰巴豆酸脱羧酶（OCD）和变构酶（OCT）。将邻苯二酚开环所产生的中间代谢产物2-羟粘康酸半醛降解为丙酮酸和乙酰辅酶A。 AD9中苯胺降解基因紧密连锁成簇,两侧由转座酶基因（IS1071）序列环绕,具有典型的基因岛（gene island）特征。AD9中苯胺代谢基因簇tad与Pseudomonas putida UCC22质粒编码的苯胺代谢基因簇tdn在序列和遗传组织上有很高的同源性,进化上可能来自同一个祖先。序列分析表明,tad基因簇是比tad基因簇更古老的基因型。AD9的tad基因簇两侧含有转座酶和IS1071序列.有可能以基因岛为一个转座单元在不同微生物属或种间转移。在AD9苯胺代谢基因簇中有5个功能尚不明确的开放阅读框,在模式菌P.putida UCC22苯胺代谢基因簇中没有发现,表明基因岛作为一个转座单元在不同微生物属或种间转移的同时,可能还伴随着基因的转移或重排,这也可能是污染环境降解微生物的生物多样性形成的一个重要原因。 构建了苯胺降解tad基因簇启动子-lacZ表达载体,β-半乳糖苷酶活性测定结果表明tad基因簇的表达受苯胺诱导。苯胺双加氧酶基因拷贝数增加的重组菌AD91在苯胺浓度600mg/l的A15

论文目录:

摘要

Abstract

第一章 苯胺及其衍生物的代谢调控研究进展

1.1 苯胺降解微生物的研究进展

1.1.1 苯胺特性

1.1.2 苯胺微生物降解的特点

1.1.3 苯胺降解细菌资源的研究进展

1.2 苯胺代谢途径的研究进展

1.3 苯胺代谢基因簇及其编码关键酶的研究进展

1.3.1 苯胺双加氧酶基因的研究进展

1.3.2 邻苯二酚双加氧酶基因及其遗传调控的研究进展

1.3.3 苯胺代谢途径基因簇克隆的研究进展

1.4 LysR-type调控蛋白对苯胺代谢途径的调控

1.4.1 LysR-type调控蛋白在芳烃化合物代谢中的关键作用

1.4.2 LysR-type调控蛋白的结构和构象

1.4.3 LysR-type调控蛋白的激活机制

1.5 转座子控制的苯胺代谢基因簇的平行转移的研究进展

1.5.1 芳烃化合物分解代谢转座子的研究

1.5.2 IS1071控制的苯胺代谢基因簇的平行转移

1.5.3 生态岛介导的芳香族化合物代谢基因簇的平行转移

1.6 苯胺代谢表达调控研究的新技术和新方法

1.6.1 苯胺降解代谢工程的应用

1.6.2 利用蛋白组学技术研究苯胺代谢

1.7 论文的目的意义

第二章 苯胺高效降解菌的分离和鉴定

2.1 材料与方法

2.1.1 实验菌株来源

2.1.2 菌株和质粒

2.1.3 培养基

2.1.4 生物化学试剂

2.1.5 酶

2.1.6 主要仪器

2.1.7 样品的富集培养和菌株的分离纯化及其驯化

2.1.8 电镜观察

2.1.9 苯胺的测定采用偶氮比色法

2.1.10 表型鉴定

2.1.11 16S rDNA的克隆和序列分析

2.1.12 G+C含量和DNA-DNA杂交

2.1.13 苯胺双加氧酶结构基因tdnQ和转座酶基因的PCR扩增

2.1.14 Southern杂交

2.1.15 脉冲场凝胶电泳

2.2 结果与分析

2.2.1 苯胺降解菌的分离纯化

2.2.2 不同苯胺浓度下菌株的电镜切片观察

2.2.3 AD9菌耐受苯胺的浓度范围

2.2.4 AD9菌在最适浓度下的生长及降解性能测定

2.2.5 AD9菌生长和降解苯胺的最佳条件

2.2.6 AD9菌抗生素抗性的鉴定

2.2.7 重金属离子对AD9菌降解苯胺的影响

2.2.8 AD9菌的表型鉴定

2.2.9 AD9菌的分子鉴定

2.2.10 苯胺双加氧酶基因和转座酶基因的克隆与序列分析

2.2.11 苯胺双加氧酶基因384bp核苷酸序列的系谱分析

2.2.12 苯胺降解菌中转座酶核苷酸序列PCR结果

2.2.13 Southern杂交验证苯胺双加氧酶基因的拷贝数

2.2.14 AD9菌的苯胺双加氧酶基因的染色体定位

2.3 讨论

2.3.1 一株新苯胺高效降解菌的分离和鉴定

2.3.2 污染环境中苯胺降解基因的平行转移

2.3.3 AD9菌染色体编码的苯胺间位降解基因簇的发现

第三章 苯胺代谢基因簇的功能筛选和序列分析

3.1 材料和方法

3.1.1 菌株和质粒

3.1.2 酶和试剂

3.1.3 培养基

3.1.4 Delftia tsuruhatensis AD9 DNA插入片段的制备

3.1.5 插入片段和载体pUC19的连接

3.1.6 连接产物的转化

3.1.7 苯胺代谢基因阳性克隆的筛选

3.1.8 限制性内切酶对目的重组子质粒的酶切验证

3.2 结果

3.2.1 基因组DNA部分酶切片段的制备

3.2.2 回收9-21kb之间的部分酶切产物与载体pUC19连接

3.2.3 苯胺代谢基因簇阳性克隆的功能筛选

3.2.4 24.7Kb片段的核苷酸及推导的氨基酸序列分析

3.2.5 染色体编码的tad基因簇和质粒编码的tdn基因簇的对比

3.2.6 AD9的AD和C23Os与其它同源蛋白系统发育的关系

3.3 讨论

3.3.1 简便快速的苯胺降解基因簇功能筛选方法

3.3.2 染色体编码完整苯胺间位裂解途径酶系的基因簇的克隆

3.3.3 质粒和染色体上相同降解转座子的发现

第四章 苯胺代谢关键酶的功能鉴定和表达调控的研究

4.1 材料和方法

4.1.1 菌株和质粒

4.1.2 酶和试剂盒

4.1.3 培养基

4.1.4 Clark电极测定苯胺双加氧酶酶活

4.1.5 代谢产物的测定

4.1.6 邻苯二酚双加氧酶的测定

4.1.7 pET28a表达载体的构建

4.1.8 SDS-PAGE蛋白电泳

4.1.9 苯胺双加氧酶基因簇在AD9和醋酸钙不动杆菌PHEA-2中的表达

4.2 结果

4.2.1 苯胺代谢关键酶的功能验证

4.2.2 tadC1和tadC2的蛋白表达SDS-PAGE分析及对不同底物酶活测定

4.2.3 苯胺双加氧酶基因在AD9和A.calcoaceticus PHEA-2中的表达

4.2.4 AD9中的苯胺代谢调控的初步研究

4.3 讨论

4.3.1 AD9苯胺代谢途径的特点及其邻苯二酚双加氧酶在代谢途径中的作用

4.3.2 AD9苯胺代谢途径基因簇的异源表达特点

4.3.3 AD9中苯胺代谢调控研究的初步结论及需解决的问题

参考文献

附录

致谢

个人简历

发布时间: 2005-09-05

参考文献

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