圆头精子症相关基因PICK1的初步功能研究

论文摘要

顶体是成熟精子头部的帽状结构,是一种起源于高尔基体的溶酶体样细胞器,在受精过程中的精卵结合步骤发挥了重要作用。顶体生成障碍导致顶体缺失或畸形是圆头精子症的典型特征。数个基因敲除小鼠模型都表现与人圆头精子症患者相似的表型,但尚未在圆头精子症患者中筛查出这些基因的突变。最近有研究者在蛋白激酶C相互作用蛋白1（PICK1）基因敲除小鼠模型中也发现与人圆头精子症相似的表型,这也是国际上首次提出PICK1为圆头精子症候选基因。目的:对四个Ⅰ型圆头精子症病人进行基因筛查,研究圆头精子症病人是否存在PICK1基因突变。并阐明mPICK1在不同发育时期小鼠睾丸中的表达和分布情况。方法:提取圆头精子症患者外周血gDNA,应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增出圆头精子症患者PICK1基因的外显子,对扩增片段进行测序检测突变,并用限制性酶切分析验证该突变。采用RT-PCR检测成年小鼠mPICK1组织表达谱,原位杂交实验研究mPICK1在成年小鼠睾丸生精细胞内的分布,Real-Time PCR检测不同发育时期小鼠睾丸组织mPICK1的表达量变化。结果:在患者二筛查出PICK1 cDNA G1567A（G-＞R）纯合突变。PvuⅡ限制性酶切检测显示,患者二出现突变导致的酶切位点消失,100个供精者结果正常,无G1567A纯合突变检出。RT-PCR结果显示mPICK1在成年小鼠各组织均有表达,在脑和睾丸的表达量最高;原位杂交结果显示mPICK1在成年小鼠睾丸的精母细胞和精子细胞中表达;Real-Time PCR显示mPICK1在不同发育时期小鼠睾丸中均有表达。结论:在患者二发现的PICK1纯合突变G1567A（G-＞R）为国际上首次报道在病人中筛查出圆头精子症相关基因的突变。PICK1基因参与生精过程。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 中英文缩写对照表
• 前言
• 1 圆头精子症的国内外研究现状
• 2 PICK1的国内外研究现状
• 3 本工作的学术意义和临床价值
• 实验技术路线
• 第一章 PICK1基因突变筛查
• 1.对象、材料和方法
• 1.1 研究对象
• 1.2 材料
• 1.3 方法
• 2.结果
• 2.1 PICK1外显子的PCR扩增结果
• 2.2 PCR产物测序结果
• 2.3 野生型和突变型PICK1基因酶切位点比较分析
• 2.4 正常人突变筛查
• 2.5 PICK1野生型和突变型蛋白的生物信息学分析
• 2.6 患者二家系分析
• 3.讨论
• 4.结论
• 第二章 mPICK1在小鼠各组织及各时期小鼠睾丸组织中的表达
• 1.材料和方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 酶及主要试剂
• 1.4 mPICK1基因cDNA PCR扩增引物和内参基因引物
• 1.5 原位杂交试剂配制
• 1.6 实验方法
• 2.结果
• 2.1 多组织RT-PCR检测成年小鼠mPICK1组织表达谱
• 2.2 成年小鼠睾丸组织切片原位杂交
• 2.3 不同发育时期小鼠睾丸组织cDNA进行Real-Time PCR
• 2.4 统计学结果分析
• 3.讨论
• 4.结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间主要研究成果