农杆菌介导的高赖氨酸基因在油菜中的转化

论文摘要

油菜是一种适应性强、用途广、经济价值高、发展潜力大的油料作物,我国60%以上的人口食用菜油。我国油菜面积和总产量均居世界首位,然而单产和品质却远远低于加拿大及其他欧洲国家。在我国由于常规油菜芥酸和硫代葡萄糖甙含量较高,严重影响了菜籽油的品质和菜籽饼粕的开发应用。因此,提高菜籽蛋白营养品质,将对我国油菜产业的发展具有重要的意义。在品质改良方面,利用基因工程手段改变油菜种子的化学组成成分及其含量是改良油菜品质的一个有效措施。其中,基因工程手段中的一个关键技术就是调节控制优良基因的表达,而高等植物基因调控主要是在转录水平上进行的,受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作用。植物基因启动子是重要的顺式作用元件,是RNA聚合酶识别并与之结合,从而起始基因转录的一段DNA序列。由于农杆菌介导的植物转基因方法具有操作简单、转化效率高、较少的拷贝数及整合机制相对简单等优点,而被植物转基因工作者广泛推崇。凡是涉及到细菌活性或愈伤组织状态的因素都可能影响其转化效果。迄今为止,油菜农杆菌转化系统仍存在不少问题,国内外的油菜转基因报道中多以某一特定品种为转化受体,其结果不具有普遍性。本研究从优化油菜再生体系入手,构建了含LRP基因和种子特异性启动子napin基因的植物表达载体,利用农杆菌介导法将该载体导入油菜中,并得以表达,试验结果如下:（1）甘蓝型油菜napin基因启动子的克隆napin是一类由多基因编码的种子贮藏蛋白,广泛存在于芸苔属植物的种子中,占种子蛋白总量的20%-30%。napin基因是在脱落酸ABA的影响下,以组织特异型方式表达。本实验根据GenBank中已经公布的napin完整全序列5’端非编码区设计引物,以甘蓝型油菜基因组DNA为模板,通过PCR扩增,获得的扩增产物克隆到pMD18-T载体。（2）LRP基因表达载体的构建通过酶切、连接等分子克隆的技术并转入大肠杆菌感受态细胞里扩增,首次将LRP基因和napin启动子整合入pBI121载体中,构建成表达载体pBI121-LRP-napin。（3）通过改变外植体的培养时间,培养基的激素配比,培养条件等,优化了子叶柄作为外植体在油菜转化中的再生体系。（4）通过农杆菌介导的方法将表达载体质粒转入油菜外植体的子叶柄中,以LRP基因引物经过PCR和PCR-Southern鉴定再生植株,得到阳性植株,这表明目的基因已经转入外植体中。最终获得了34棵阳性苗,其中19棵已在温室里存活,并开花结籽,并有15棵在培养箱里进行生根培养等待移栽。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 转基因油菜常用的方法
• 1.1.1 农杆菌介导法
• 1.1.2 电激法
• 1.1.3 基因枪法
• 1.1.4 微束激光转化法
• 1.1.5 真空渗入遗传转化法
• 1.1.6 花粉管通道法
• 1.2 转基因与油菜品质改良
• 1.2.1 脂肪酸的遗传改良
• 1.2.2 蛋白质的遗传改良
• 1.3 油菜转基因的遗传特性
• 1.3.1 外源基因的表达调控
• 1.3.2 启动子及种类
• 1.3.3 外源基因的遗传特性及传递规律
• 1.3.4 外源基因沉默
• 1.4 菜籽饼粕研究进展
• 1.4.1 油菜饼粕综合利用意义
• 1.4.2 菜籽蛋白质氨基酸组成
• 1.4.3 赖氨酸基因研究进展
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒及菌种
• 2.1.3 重要试剂
• 2.1.4 重要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 油菜种子特异性启动子载体的构建
• 2.2.2 农杆菌介导的转化体系的建立
• 2.2.3 农杆菌介导的高赖氨酸基因的转化及分子鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 油菜种子特异性启动子载体的构建
• 3.1.1 napin 基因克隆及载体的构建
• 3.1.2 LRP 基因的获得并载入pBI121 载体中
• 3.1.3 napin 启动子导入pBI121 载体中
• 3.1.4 表达载体导入根癌农杆菌的转化
• 3.2 农杆菌介导的转化体系的建立
• 3.2.1 培养基激素浓度配比的选择
• 3.2.2 AS 对转化效率影响的比较
• 3.2.3 侵染时间的比较
• 3.2.4 共培养时间的比较
• 3.3 农杆菌介导的高赖氨酸基因的转化及分子鉴定
• 3.3.1 抗性苗的获得
• 3.3.2 抗性苗的PCR 鉴定
• 3.3.3 抗性苗的PCR-Southern 鉴定
• 3.4 转基因油菜表型观察
• 4 讨论
• 4.1 油菜转基因体系的建立
• 4.2 农杆菌介导的转化体系
• 4.3 高赖氨酸基因的表达
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 硕士期间发表的研究论文