大菱鲆钙激活型钾离子通道TSKCa基因的克隆和时空表达特征

论文摘要

离子通道是位于细胞膜表面的一种膜蛋白,为各种无机离子跨膜运输提供通路。离子通道的主要功能是通过启闭通道控制离子进出细胞,启动细胞内信号传导系统,激活细胞内各种重要的生理活动。在动物免疫应答过程中,离子通道调控免疫细胞的激活与增殖,启动细胞的免疫反应。因此,离子通道对维系动物免疫系统的正常功能起着非常重要的作用。长期以来的研究发现离子通道是多种新药的作用靶点,因此对离子通道的研究始终是生物医学界的前沿领域。钙激活型钾离子通道（KCa）是位于免疫细胞细胞膜表面调节细胞功能的一类重要的通道。通过比较GenBank中不同KCa基因的同源相似性,设计出特异性引物,以我国海水养殖大菱鲆（Scophthalmus maximus L）血液cDNA为模板利用RT-PCR技术克隆获得了一条基因片段。使用生物信息学手段对该基因片段序列进行了比对和分析,证实该片段属小电导钙激活型钾通道基因（SKCa）家族。设计巢式PCR引物通过5`race克隆得到了该基因的5`端序列,通过3`race克隆得到了该基因的3`端序列,通过生物学软件拼接合成三段序列得到了大菱鲆TSKCa基因的全长序列。TSKCa基因序列全长为1698bp,其中开放阅读框长度为1632bp,编码的TSKCa蛋白有544个氨基酸。使用生物信息学软件将TSKCa蛋白与GenBank中已有的SKCa蛋白进行同源性分析,构建系统进化树,使用SeqFact和DAS服务器对TSKCa蛋白进行跨膜结构预测,并且根据已有的研究结果推测TSKCa蛋白的结构,推断出TSKCa蛋白由S1-S6六个跨膜结构域和一个孔道区（P区）组成。鉴于对SKCa基因在鱼类免疫应答中的作用研究报道很少,对克隆得到的TSKCa基因在大菱鲆不同器官组织的表达以及在鳗弧菌感染情况下的表达进行了研究,发现TSKCa基因在多数受检大菱鲆的各种组织器官中都有分布,在感染鳗弧菌后TSKCa基因在各种组织器官中的表达量呈明显上升的趋势,其中在脑、头肾、脾脏和血液中表达量的增高明显。而在肝脏和肠中的相对表达量变化较小,表明TSKCa基因在大菱鲆的免疫防御,抵抗病原菌的侵染过程中有可能起重要的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 离子通道概论
• 1.2 钾离子通道概论
• 1.2.1 钾离子通道的功能
• 1.2.2 钾离子通道的核心结构及分类
• 1.2.3 钾离子通道的研究进展
• 1.3 钙激活型钾离子通道的功能特点及研究进展
• 1.4 钾离子通道与鱼类的免疫机制
• 1.4.1 鱼类免疫机制概述
• 1.4.2 钾离子通道在免疫机制中所起的作用
• 1.5 实验材料简介
• 第二章 大菱鲆TSKCA 基因的克隆及序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要试剂和仪器
• 2.1.3 TSKCa 基因PCR 引物设计
• 2.1.4 总RNA 的提取
• 2.1.5 逆转录合成cDNA
• 2.1.6 PCR 反应预实验
• 2.1.7 PCR 扩增大菱鲆TSKCa 基因的cDNA 核心序列
• 2.1.8 试剂盒回收PCR 扩增片段
• 2.1.9 PCR 扩增片段T-A 克隆入载体和序列测定
• 2.1.10 用CaC12制备感受态细胞
• 2.1.11 感受态细胞的转化
• 2.1.12 PCR 检测含阳性克隆的转化菌落
• 2.1.13 测序结果验证
• 2.1.14 大菱鲆TSKCa 基因的5`Race
• 2.1.15 大菱鲆TSKCa 基因的3`Race
• 2.1.16 大菱鲆TSKCa 基因序列的拼接
• 2.1.17 大菱鲆TSKCa 基因序列的生物信息学分析
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 总RNA 的提取
• 2.2.2 PCR 反应预实验
• 2.2.3 PCR 扩增大菱鲆TSKCa 基因的cDNA 核心序列片段
• 2.2.4 大菱鲆TSKCa 基因的5`Race
• 2.2.5 大菱鲆TSKCa 基因的3`Race
• 2.2.6 大菱鲆TSKCa 基因全长cDNA 的克隆
• 2.2.7 大菱鲆TSKCa 基因序列的生物信息学分析
• 2.3 讨论
• 第三章 大菱鲆 TSKCA 基因的时空表达特征
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要试剂和仪器
• 3.1.3 TSKCa 基因在大菱鲆不同组织的表达
• 3.1.4 大菱鲆 TSKCa 基因在不同感染时间各组织的表达
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 TSKCa 基因在大菱鲆不同组织的表达
• 3.2.2 TSKCa 基因在大菱鲆不同组织不同感染时间的表达
• 3.3 讨论
• 致谢
• 硕士在读期间发表的相关论文