FAT10功能域的活性分析

论文摘要

类泛素蛋白家族是一类结构域与泛素有很高同源性的小分子量蛋白,对细胞的生长调控起着多种重要作用。FAT10又被称为双泛素,是类泛素家族的成员之一。FAT10主要表达在胎盘、胸腺、脾、淋巴结,胚胎等与免疫系统功能密切相关的组织中。胃肠癌、肝癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌等多种癌症中,FAT10也存在过表达现象。FAT10与抑癌基因p53关系密切,并参与细胞凋亡调控,研究表明FAT10以类似泛素的方式与底物蛋白质共价连接,并促进其降解,但具体调控机制尚不清楚。因此,对FAT10结构与功能的活性研究,可以进一步深入了解FAT10在细胞周期调控以及癌症发生发展过程中的作用,为癌症的临床治疗提供新的策略。在本研究中,我们以人类胸腺cDNA文库为模板,成功扩增了FAT10的全长开放阅读框,并将其构建到哺乳动物表达载体pCMV-HA中获得pCMV-HA-FAT10重组质粒。并进一步构建FAT10的N端及C端泛素结构域,以及FAT10末端双甘氨酸基团突变的FAT1O△GG于pCMV-HA真核表达载体,成功表达出FAT10-HA, FAT10-N-HA,FAT10-C-HA,FAT10AGG-HA融合蛋白。我们将FAT10及各突变体瞬时转染HEK293T细胞,并使用26S蛋白酶体抑制剂MG132处理,通过Western Blotting实验检测野生型FAT10及其突变体结合底物蛋白质的活性,发现FAT10的C末端双甘氨酸基团以及双泛素结构域都是FAT10与底物共价结合所需的活性基团,被FAT10标记后的底物蛋白质通过26S蛋白酶体途径降解。为了进一步检测FAT10及其N、C端结构域降解底物蛋白质的活性,我们成功构建并表达了FAT10及其独立的双泛素结构域标记在EGFP蛋白质N末端的融合蛋白,并通过Cycloheximide chase反应检测FAT10极其截断突变体对EGFP降解的影响。发现FAT10极其双泛素结构域都具有促进EGFP降解的活性。我们又通过Annexin-V细胞凋亡检测方法检验了FAT10极其截断突变体对细胞凋亡活性的影响,发现FAT10极其N、C端均促进HEK293T细胞凋亡。结果表明FAT10的两个类泛素结构域是FAT10标记并促进蛋白质降解以及FAT10促进HEK293T细胞凋亡的重要基团。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料和方法
• 1 材料
• 2 实验方法
• 结果
• 1 FAT10基因的克隆
• 2 FAT10野生型及突变体真核表达载体的构建
• 3 FAT10及各突变体融合蛋白在HEK293T细胞中的表达
• 4 FAT10共价结合底物蛋白质的活性分析
• 4.1 野生型FAT10具有共价结合底物蛋白质的活性
• 4.2 FAT10通过C末端双甘氨酸基团及双泛素结构域共价结合底物蛋白质
• 4.3 FAT10与底物蛋白质结合后促进其在26S蛋白酶体的降解
• 5 FAT10促进EGFP蛋白质降解
• 5.1 pEGFP-N2-FAT10,pEGFP-N2-FAT10-N,pEGFP-N2-FAT10-C克隆构建
• 5.2 荧光检测EFAT10-GFP,FAT10-N-EGFP,-FAT10-C-EGFP融合蛋白质在HEK293T细胞中表达
• 5.3 FAT10,FAT10-N,FAT10-C促进长周期蛋白质EGFP降解
• 6 血清饥饿条件下FAT10,FAT10-N,FAT10-C对293T细胞凋亡活性的影响
• 7 FAT10,FAT10-N,FAT10-C对p53蛋白质的影响
• 讨论
• 小结
• References
• 致谢