RNA干扰SHP-1对乳腺癌细胞功能影响的研究

论文摘要

研究背景有资料显示,乳腺癌发病率占全身各种恶性肿瘤的7%-10%。据统计,全球每年有120～140万妇女患乳腺癌,约有50万患者死于该病。在美国2009年乳腺癌的新增病例数超过19万,占女性恶性肿瘤的首位；另有4万死于乳腺癌。在我国妇女乳腺癌的发病率也逐年递增,10年间,上海、北京和深圳等一些城市乳腺癌发病率上升了40%。乳腺癌严重影响着女性身心健康,甚至危及生命。有效地预防和治疗乳腺癌成为了目前肿瘤研究的焦点。随着现代分子生物学的发展,研究者们逐渐认识到在蛋白水平的磷酸化和去磷酸化之间的平衡在细胞正常信号转导及肿瘤发生、发展过程中取着非常重要的作用。目前研究较多的是受体酪氨酸激酶（PTKs）和酪氨酸磷酸酶（PTPs）。在乳腺癌的发生发展中,有学者认为存在细胞内磷酸化水平的失衡,即酪氨酸磷酸酶活性降低及/或酪氨酸激酶活性增强。酪氨酸激酶及酪氨酸磷酸酶对调节细胞内蛋白磷酸化水平起着非常重要的作用。表皮生长因子受体酪氨酸激酶是其中最大的一类酶联受体。表皮生长因子受体家族（也称为ErbB受体家族）,包括EGFR（HER1/ErbB-1）、HER2 （ErbB-2/neu）、HER3 （ErbB-3）、HER4 （ErbB-4）。ErbB配体诱导受体酪氨酸激酶的二聚化,从而激活受体激酶活性。配体与受体结合,能够诱导受体形成同源二聚体或者异源二聚体,这些二聚体在介导细胞增殖、分化、转移等信号传导中起着重要的作用。在乳腺癌患者中,20%～30%的患者存在HER2的高表达,研究表明HER2为乳腺癌预后的独立指标,且可以作为指导治疗并预测疗效的指标,HER2高表达的乳腺癌恶性程度高,易发生耐药,易转移复发,患者的预后差。目前,针对乳腺癌HER2高表达的抗肿瘤分子靶向药物主要有曲妥珠单抗（Trastuzumab）,虽然它的应用取得了令人鼓舞的疗效,但是临床应用中发现多数治疗有效的患者一年内出现耐药。提示研究如何扭逆乳腺癌对曲妥珠单抗等分子靶向药物的耐药的重要性,有研究表明这种耐药可能HER家族分子间或者其他受体分子间的交互激活有关。曲妥珠单抗可以阻断了HER2受体与配体的结合,但是不能阻断其他受体通路激活后,而激活HER2的激酶,同样导致细胞内蛋白磷酸化水平的升高。更多的证据证实,HER3的活化是HER2治疗逃逸的重要原因。最近一系列的细胞实验和临床研究显示EGFR、HER2、c-Met等激酶分子可以使HER3胞内区的酪氨酸磷酸化,活化的酪氨酸直接激活PI3K/Akt通路。而HER3缺乏蛋白激酶活性,仅是EGFR、HER2和c-Met激酶的基质,作为一个结头分子或募集分子介导信号,不是小分子靶向药物的直接靶点。曲妥珠单抗虽可以阻断肿瘤细胞中HER2的自身磷酸化活性,但是HER3的这种转磷酸化活性却不受抑制,它不是TKI的直接靶点。HER3的存在对分子靶向药物治疗模式提出了挑战。当以HER2为靶点的抗乳腺癌药物出现耐药时,我们设想是否可以通过调控酪氨酸磷酸酶去磷酸化作用,使得胞内高水平的蛋白磷酸化降低到一定水平,以恢复细胞原有的蛋白磷酸化平衡,使细胞恢复胞内蛋白磷酸化水平的稳态。目前已分离纯化的PTPs家族成员有40多个,其中SHP-1基因是近年发现的一个重要的候选抑癌基因,并且Yip等人已经证实了其在乳腺癌发生发展中的重要作用,同时发现其可以和细胞蛋白磷酸化的酪氨酸特异性结合并催化其去磷酸化。它通过直接去磷酸化作用调节细胞内信号蛋白分子酪氨酸的磷酸化水平,抑制细胞的有丝分裂、增殖、分化和生物活性。我们在前期工作中,分别检测了30例早期、HER-2阳性和转移性乳腺癌的标本,发现SHP-1的表达在HER-2阳性和转移性乳腺癌的标本中明显降低。而当我们通过乳腺癌MDA-MB-231细胞株转染SHP-1基因后,肿瘤细胞的增殖受到了明显的抑制。综合我们前期工作,我们可以推断SHP-1的去磷酸化作用可使肿瘤细胞逆转其信号通路的过度激活。HER-2表达升高和SHP-1表达下降,导致蛋白磷酸化及去磷酸化平衡破坏,磷酸化信号过度活化,细胞恶性程度及侵袭能力增加。SHP-1主要通过对生长因子受体或非受体蛋白酪氨酸激酶的脱磷酸作用起着重要的负性调节作用。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteases MMPs）是具有降解细胞外基质的一组依赖锌的内肽酶类多基因家族。MMPs在乳腺癌发生复发和转移中取着重要作用,其中MMP9是其中重要一员,其表达产物在肿瘤细胞侵袭转移过程中不仅可以酶解细胞间基质成分,还能酶解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原。并且Hiratsuka等人的实验室构建的转移小鼠模型中发现,在原发灶的募集反应之后,肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associatedmacrophages TAMs）经过血流到达远处器官。当远处器官阳性表达VEGFR-1及能够诱导大量MMP9表达的内皮细胞,（这时的MMP9多于循环血液中的TAMs）,就会促进转移的发展。还认为MMP9是肿瘤细胞穿越基地膜的限速酶。越来越多的证据表明,MMPs不仅仅是乳腺癌诊断和预后,中期检测和危险评估的潜在蛋白指标,并且是肿瘤复发、转移,以及对初始和术后辅助化疗反应的预测指标。有研究表明在乳腺癌患者的血清、血浆及尿液有MMP9显著升高。包括区域淋巴结转移、肝转移及骨转移在内的转移性乳腺癌中,一些独立的研究机构通过循环血中的MMP9的活性来检测这些肿瘤对初始或者辅助化疗的治疗反应评价。研究还发现血浆中高水平MMP9与肿瘤发生区域淋巴结转移及低水平的无病生存率及总生存率相关。MMPs可能在预测肿瘤的治疗效果中取着重要作用,切除原发乳腺肿瘤后血清中的MMP9水平降低,在辅助治疗效果良好的患者中也能够发现血清中MMP9明显下降。更重要的是,在临床诊断乳腺癌复发前1到8个月能够检测到MMP9水平的逐渐升高。既然MMP9与乳腺癌的复发和转移密切相关,是否它和SHP-1也存在一定的联系呢?目的已有研究揭示了SHP-1蛋白对肿瘤抑制作用,但其在乳腺癌细胞中的具体作用机制仍不十分清楚,其底物分子也尚未完全明确。在本研究中瞬时干扰SHP-1基因,经RT-PCR和Western-blot检测干扰效率后,通过Transwell小室实验检测干扰SHP-1前后乳腺癌细胞侵袭能力,并通过RT-PCR检测干扰前后MMP-9基因变化,于探讨SHP-1对人乳腺癌细胞株MCF-7侵袭能力的影响,并初步揭示其作用机制,同时检测干扰后细胞周期及细胞增殖能力的变化。方法第一章瞬时干扰SHP-1基因并检测其干扰效率1.人乳腺癌MCF-7细胞株的瞬时干扰上海吉玛公司设计并合成的SHP-1siRNA干扰序列分别如下：siRNA（SHP-1）:Sense5’GC AAGAACCGCU AC AAGAATT3’; Anti-sense 5’U UCUUGUAGCGGUUCUUGCTT3’; siRNA control:Sense5’UUCUCCGAACGUG UCACGUTT3’, Anti-sense 5’ACGUGACACGUUCGGAGAATT3’。将细胞培养至对数生长期,转染前24h分别适量接种于6孔板中,予含10%胎牛血清的RPMI-1640培养,当细胞覆盖瓶壁达约80%,用1×PBS冲洗细胞2次,每孔中加入适量Opti-MEN I继续培养；准备转染复合物：取3支EP管,标记为siRNA、NC和Mock,取8μl siRNA加入50μl Opti-MEMI中混合均匀,4glLipofectamine 2000用50μl Opti-MEM I均匀混合,5分钟后两者均匀混合,并以合适计量加入每孔细胞（其中Mock组为只加lipofectamine,不加siRNA）。然后37℃、5%C02培养6h,弃去培养液,1×PBS冲洗细胞2次后,换用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基继续培养48h。分别进行RT-PCR、Western-blot、transwell小室实验及细胞增殖能力实验。2.荧光定量PCR （Real-time PCR RT-PCR）检测干扰效率干扰处理后,细胞生长至对数生长期,抽提总RNA,按逆转录试剂盒说明合成cDNA,配制好荧光定量PCR反应试剂后,使用ABI7500定量PCR仪对基因SHP-1及β-actin的相对表达量进行检测。反应条件：stage 1:95℃预变性10s; stage2:40个循环,95℃变性5s,60℃退火34s,stage3:Dissociation Stage。3. Western-blot鉴定分别将转染了干扰组、NC组及Mock组MCF-7细胞分别裂解,并提取全蛋白,BCA法测定蛋白浓度。各取30μg上述蛋白样品进行8%SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭、抗SHP-1抗体4℃孵育、TBST洗膜3次、HRP标记的二抗孵育、再次TBST洗膜3次后、化学发光法显影。对显影条带进行密度扫描定量, image J图像分析系统测各条带平均吸光度（A）值和条带面积,用SHP-1与β-actin的光密度比值表示SHP-1表达的水平。第二章干扰SHP-1基因后乳腺癌细胞功能的变化1. Transwell小室实验MCF-7细胞经过干扰处理48h后,无血清PRMI-1640重悬细胞,调整细胞数为1.0×106个/ml。吸出内室中培养液,加500μl含10%胎牛血清的培养液于外室中,加200μl细胞悬液以及0.1%BSA于内室,37℃、5%C02培养箱中培养12h。取出小室,吸掉培养液,棉签擦掉未穿孔细胞。将小室浸入结晶紫中染色20min,用蒸馏水冲洗数次,风干。显微镜观察,随机选取5个高倍视野计数穿孔细胞数。2.荧光定量PCR检测MMP9基因的表达瞬时干扰后,细胞生长至对数生长期,抽提总RNA,按逆转录试剂盒说明书合成cDNA,然后配制好荧光定量PCR反应试剂后,使用ABI7500定量PCR仪对基因MMP-9及β-actin的相对表达量进行检测。反应条件同前。3.收集干扰后细胞,通过细胞周期试剂盒配制反应液后,流式细胞仪检测NC组及siRNA组细胞周期变化。4.干扰SHP-1基因后MTT法检测细胞体外增殖能力变化瞬时干扰后,细胞生长至对数生长期,干扰及对照组MCF-7细胞以每孔1×104个细胞/孔密度接种96孔板,培养24h。用MTT法检测]NC、Mock及siRNA三组乳腺癌细胞体外增殖能力的变化。统计学方法应用SPSS13.0软件进行统计学处理,计量资料以均数±标准差（x±S）表示。不同实验组整体比较采用ONE-WAY ANOVA。Western-blot实验及Transwell小室实验结果进行多重比较,采用LSD检验；方差不齐时,采用Welch法。细胞周期实验采用独立样本的t检验。MTT细胞增殖检测实验采用析因设计方差分析比较各组间差异；P<0.05为有统计学意义。结果第一章瞬时干扰SHP-I基因并检测其干扰效率1.从经过处理的人乳腺癌MCF-7细胞中提取总RNA,经逆转录成cDNA后,荧光定量PCR检测发现,SHP-1基因于NC、Mock及siRNA组均有表达,siRNA组表达量低于NC及Mock组,与预期实验结果一致。2.从NC、Mock及siRNA三组细胞中提取总蛋白,经Western blot检测,结果表明大小为68KD的SHP-1蛋白于NC、Mock及siRNA组均有表达,并且siRNA组蛋白的表达量显著低于NC及Mock组（均有P<0.05）,与预期实验结果一致。3.通过荧光定量PCR及Western blot检测,本实验通过脂质体转染法成功地在人乳腺癌MCF-7细胞株瞬时干扰了SHP-1基因的表达。第二章干扰SHP-1基因后乳腺癌细胞功能的变化1.经过处理的人乳腺癌MCF-7细胞,通过调整细胞数目为1.0×106个/ml,通过Transwell小室实验,穿孔细胞计数后表明干扰SHP-基因表达后,siRNA组的穿孔细胞数显著多于NC及Mock组（均有P<0.05）。实验结果表明干扰SHP-1表达后MCF-7细胞侵袭能力增强。2.从NC、Mock及siRNA三组细胞中提取总RNA,经荧光定量PCR检测发现,干扰MCF-7细胞SHP-1基因后,siRNA组中基因MMP9的表达量高于NC及Mock组。3.通过流式细胞仪检测NC组及siRNA组细胞周期后,发现NC组G1期细胞占55.68%,而siRNA组G1期细胞占42.93,干扰SHP-1表达后G1期所占细胞显著减少（P<0.05）,S及G2期细胞增多（P<0.05）。4.采用MTT法检测三组细胞的生长特性,结果表明与NC及Mock组相比,siRNA组的MCF-7细胞增殖速率显著增高（均有P<0.05）。结论1.荧光定量PCR及Western blot实验均证实了SHP-1基因在乳腺癌MCF-7细胞中表达,验证了磷酸酶存在于乳腺癌中,为我们继续研究酪氨酸磷酸酶的作用提供了客观依据。2.干扰了SHP-1基因的MCF-7细胞分别通过荧光定量PCR及Western blot的方法检测到SHP-1基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。而且不论是mRNA水平,还是蛋白水平,siRNA组表达均低于NC及Mock组。说明瞬时干扰成功,并为下一步实验做好了前期准备。3. Transwell小室实验结果证实了,干扰SHP-1基因后,siRNA组的穿孔细胞数显著高于NC及Mock组。实验结果表明干扰SHP-1表达后MCF-7细胞侵袭能力增强。表明当干扰SHP-1表达后,磷酸化的活性增强,从而加强下游通路的激活,增强了肿瘤细胞的侵袭能力。4.干扰了SHP-1基因的MCF-7细胞通过荧光定量PCR检测MMP9基因的表达,实验结果表明siRNA组中基因MMP9的表达量高于NC及Mock组。可能表明SHP-1蛋白和MMP9蛋白的激活通路存在一定的联系,当SHP-1蛋白存在时,能够激活MMP9的分子处于抑制状态。5.细胞周期检测发现,siRNA组G1期细胞减少,G2及S期细胞增多,发生细胞周期后移现象,提示干扰SHP-1基因表达后乳腺癌MCF-7细胞的DAN合成能力增强。6.MTT法检测细胞增殖显示,siRNA组较NC及Mock组细胞的增殖能力增强。提示SHP-1基因表达对乳腺癌MCF-7细胞的增殖有抑制作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 瞬时干扰SHP-1基因并检测其干扰效率
• 1 实验材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 干扰SHP-1基因后乳腺癌细胞功能的变化
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 中英文缩略词表
• 攻读硕士学位期间成果
• 致谢
• 统计合格证明