论文摘要
Survivin是已鉴定的8个凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein,IAP）家族成员:X-IAP、c-IAP-1、c-IAP-2、NIAP、ILP2、ML-IAP/Livin、apollon和survivin中分子量最小（16.5kD）,最具有基础和临床意义而受广泛关注的明星分子[1]。与其他的IAPs家族成员不同,survivin在近乎所有的人类肿瘤中高表达,而对应的癌旁组织和人体终末分化组织不表达;survivin表达的另一个特点是受细胞周期严格调控,在G1期表达极低,S期为G1期的6倍,G2/M期则增高至40倍!显示其表达具有G2/M期依赖的特异性[2]。更重要的是,通过临床的回顾性分析发现,survivin的高表达是肿瘤进展快和恶性度高的可靠指标,意味着肿瘤治疗抗性,患者存活期缩短,复发率增高;反之,通过其反义分子、RNA干涉、核酶、负显性突变体以及小分子抑制剂等手段降低survivin表达或抑制survivin功能,都可以促进肿瘤细胞凋亡而增强肿瘤对治疗的敏感性。因此,survivin被称为关键癌基因（pivotal cancer gene）[3,4,5]。目前,以拮抗survivin为目的的抗肿瘤药物和基因治疗方案已有多项进入临床前或临床研究[6]。值得关注的是,在肿瘤治疗的基础研究中发现:多种肿瘤细胞系和肿瘤组织,对于DNA损伤剂类化疗药物诸如顺铂,阿霉素等诱导的survivin表达增高与肿瘤对药物的治疗抗性直接相关[7]!从而影响了这些DNA损伤药物的临床应用效果。然而,旨在直接抑制survivin表达的治疗策略却能增强肿瘤细胞对DNA损伤药物的敏感性。因此,开展survivin抗DNA损伤应激机制的研究工作将对临床用药具有指导意义。为此,我们以DNA损伤药物治疗反应中survivin诱导表达升高的分子机制这一科学问题为研究切入点,采用目前临床常用的DNA损伤剂类化疗药-表阿霉素和HeLa细胞系为主要的实验材料,从转录调控、mRNA水平、蛋白稳定性及细胞定位等角度综合研究survivin在DNA损伤应激反应中的表达调控,以期揭示survivin在肿瘤细胞拮抗DNA损伤应激反应的分子机制,并为以survivin为靶标的肿瘤治疗策略的应用提供理论指导。1)建立表阿霉素诱导HeLa细胞中survivin表达增高的研究模型。首先,通过免疫印迹技术检测不同浓度梯度和不同作用时间的表阿霉素对肿瘤细胞中survivin蛋白表达水平的调控作用。结果显示,表阿霉素诱导survivin表达上调具有明显的时间和浓度梯度依赖性。细胞周期同步化实验证实survivin在对照组HeLa细胞中严格遵守周期时相依赖的表达规律,同时发现表阿霉素能诱导同步化于G1期的HeLa细胞中survivin表达上调,即表阿霉素能诱导非周期依赖的survivin表达上调。通过台盼蓝活细胞计数显示,表阿霉素诱导HeLa细胞中survivin表达增高同肿瘤细胞的化疗抗性密切相关: survivin knockdown-HeLa细胞中存活细胞减少;survivin overexpression-HeLa细胞中存活细胞增多。2)以真核基因表达调控的多层次复杂调控模式为依据,探讨表阿霉素影响survivin表达调控的可能环节。survivin近端启动子序列的双荧光素酶活性检测发现,表阿霉素并未增加survivin的转录起始活性;实时定量PCR结果显示表阿霉素对survivin的mRNA水平没有显著影响;而用蛋白合成的非特异性抑制剂放线菌酮检测survivin的半衰期实验表明,表阿霉素增加了survivin蛋白的稳定性。同时证明,外源性survivin也可被表阿霉素上调。上述结果表明:表阿霉素对HeLa细胞中survivin的表达调控发生在蛋白水平,抑制了survivin的降解。已有的研究工作揭示,p53-survivin构成的转录抑制调控网络在抗DNA损伤药上具有重要意义[8]。考虑到HeLa细胞中p53蛋白被人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）表达的原癌蛋白E6所降解,我们通过表达外源野生型p53而增加p53蛋白的表达量。结果显示,p53活性增高尽管可以在一定程度上抑制survivin近端启动子活性,但对survivin的mRNA和蛋白表达水平没有显著影响,可能是p53-survivin转录抑制调控网络与更为精细复杂的时空表达选择机制相关联。3)免疫荧光检测发现,表阿霉素能使survivin的定位由细胞质转移到细胞核,对GFP-survivin融合蛋白的荧光共聚焦观察进一步验证了此结果。免疫印迹检测显示细胞核内survivin蛋白水平随表阿霉素药物浓度升高而增高,而细胞质内survivin蛋白水平保持不变甚至降低。作用不同时间点,荧光计数定位发现表阿霉素（0.5μg/ml）可以在3小时内使大部分细胞的survivin主要募集至细胞核,并且这种定位效应与细胞周期不相关。为此,进一步探讨了调节survivin核质定位的核孔转运蛋白CRM-1在表阿霉素诱导survivin核内累积中的功能。CO-IP结果显示,表阿霉素对CRM-1与survivin的结合没有显著影响;免疫荧光共定位结果表明,表阿霉素没有改变GFP-survivin和CRM-1的共定位数量,但使其共定位从核膜转移到了细胞核内。提示表阿霉素通过改变CRM-1/survivin复合物的定位,使survivin不能有效的转运到细胞质。4)原位胞质去除的免疫组化研究发现,GFP-survivin与DNA染色的DAPI荧光共定位,即表阿霉素使survivin结合于染色质结构。在低渗有丝分裂染色体制备实验中,意外地发现表阿霉素可以强烈的阻止HeLa细胞进入M期,而用RNAi抑制survivin则可以使少量的HeLa细胞进入M期,但染色体形态出现异常。彗星尾实验检测发现,过表达survivin的HeLa细胞中药物作用后DNA损伤程度轻,而通过RNAi抑制survivin表达的HeLa细胞中DNA损伤程度重,提示:survivin可能有促进DNA损伤修复的功能。凋亡检测发现,用survivin34A DN抑制survivin表达使HeLa细胞的凋亡比例比空载体对照可增加79.2%。因此,实验结果提示survivin增高在表阿霉素作用12小时表现为减少凋亡诱导,这至少部分是survivin促进DNA损伤修复的结果,但有待于进一步深入揭示其抗DNA损伤的分子机制。综合上述实验结果,本课题的研究证明:DNA损伤剂表阿霉素诱导HeLa细胞中survivin的表达增高同肿瘤细胞的化疗抗性密切相关。表阿霉素作用于肿瘤细胞后,survivin快速结合于细胞核内的染色质结构,使其不能或减弱了在细胞质内的降解,因此半衰期增加,蛋白水平上调而mRNA水平没有显著改变。本研究首次观察到在表阿霉素引起的DNA损伤反应过程中survivin细胞核转位并结合于染色质结构,以及使M期进入受阻和促进DNA损伤修复。这一现象为深入研究survivin的抗DNA损伤机制提供线索,有助于揭示survivin抗肿瘤治疗的分子机制,为DNA损伤剂类化疗药物的临床应用提供科学指导。