粟酒裂殖酵母核糖体蛋白L32的转录调控因子的筛选与鉴定的初步研究

论文摘要

本文主要研究是粟酒裂殖酵母核糖体蛋白L32-1和L32-2的启动子及其转录调控因子,通过分子生物学和生物信息学的方法确定了启动子的范围,通过酵母单杂交的方法找到了一组启动子结合蛋白,该蛋白能分别与两个核糖体的启动子相互作用。本实验室之前的实验通过不同实验的研究证明了RPL32-1和RPL32-2在细胞内存在不同功能,RPL32-1、RPL32-2在细胞处于不同生长状态下表达水平不同；当细胞进入沉默状态时RPL32-1高表达抑制细胞分裂；而细胞处于对数期时RPL32-2高表达则促进细胞分裂。因此,RPL32的同源基因的功能差异,进一步证明了重复的核糖体蛋白的同源基因在细胞内都存在不同的功能。核糖体蛋白是细胞翻译机制的重要组成部分,核糖体蛋白基因的转录和翻译效率直接影响着细胞翻译机制的功能。本论文在前期研究的基础上,对启动子和调控因子进行初步探索。首先通过分子生物学和生物信息学的方法分析两个核糖体蛋白的启动子序列特征。RPL32-1的启动子在转录起始位点上游200bp,其中,120bp到200bp处存在增强子序列。RPL32-2的启动子在转录起始位点上游1000bp,其中,900bp到1000bp处存在增强子。利用酵母单杂交技术,确定了一组启动子结合蛋白RPLX,并确定RPLX1与RPL32-2的启动子能够相互作用,而RPLX1与RPLX2和RPL32-1的启动子都能有相互作用。在之前的实验中还并未发现该核糖体蛋白有启动子结合蛋白的作用,后续实验可以进一步探究该蛋白与启动子的结合位点和调节作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 一 核糖体蛋白以及同源基因的研究
• 二 真核生物启动子特点
• 1. 核心元件
• 2. 上游启动元件（UPE）
• 3. 远端调控区
• 3.1 增强子（enhomcer）
• 3.2 减弱子（dehancer）
• 3.3 上游激活序列（upstream activating seguences UASs）
• 3.4 静息子（sisencer）
• 三 同源核糖体蛋白启动子及其结合蛋白的研究
• 1 启动子序列的分析方法
• 2 启动子结合蛋白的研究方法
• 四 本论文研究思路
• 第二章 粟酒裂殖酵母核糖体蛋白L32-1和-2的启动子序列的研究
• 第一节 构建含有启动子序列和报告基因的菌株
• 1 实验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂器材及来源
• 1.4 主要溶液
• 1.5 引物
• 1.6 其他材料
• 1.7 菌种培养与保藏
• 2 试验方法
• 2.1 基因组的提取
• 2.2 核糖体蛋白L32-1和L32-2的上游序列和报告基因LacZ的克隆
• 2.3 核糖体蛋白L32-1和L32-2的上游序列和报告基因LacZ的连接到目的载体上
• 2.4 含有质粒pREP82X-LacZ-X的粟酒裂殖酵母菌株yAS56的构建
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增片段结果
• 3.2 目的片段连pMD-18T阳性克隆筛选结果
• 3.3 大体系酶切纯化回收片段结果
• 3.4 目的片段连接到质粒pREP82X-LacZ上筛选阳性克隆的结果
• 3.5 验证含有上游序列和报告基因的质粒pREP82X是否化转到粟酒裂殖酵母yAS56中
• 第二节 通过酶活测定的方法确定启动子序列
• 1 实验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂器材及其来源
• 1.4 主要溶液配制
• 2 实验方法
• 2.1 制备粗酶提取物并通过蛋白定量分析进行酶活力的均一化
• 2.2 测定酵母β—半乳糖苷酶酶活
• 2.3 采用Bradford法测定抽提物中的蛋白浓度
• 2.4 计算公式
• 3 结果
• 3.1 蛋白标准曲线
• 3.2 粟酒裂殖酵母yAS56/pREP82X-LacZ-X的β—半乳糖苷酶酶活
• 第三节 生物信息学分析启动子
• 第四节 本章小结
• 第三章 核糖体蛋白的启动子结合蛋白的研究
• -CDNA文库'>第一节 构建粟酒裂殖酵母972H^-CDNA文库
• 1 实验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂和器材
• 1.4 主要溶液和试剂
• 1.5 引物
• 2 实验方法
• -的total RNA'>2.1 提取野生型粟酒裂殖酵母972h^-的total RNA
• 2.2 去除总RNA中的DNA
• 2.3 验证DNA去除效果
• 2.4 mRNA的纯化
• 2.5 mRNA反转录第一链cDNA SMART cDNA
• 2.6 LD-PCR扩增SMART cDNA
• 2.7 回收ds cDNA
• 3 结果
• 3.1 RNA的提取情况
• 3.2 去除总RNA中的DNA
• 3.3 验证DNA去除效果
• 3.4 mRNA的纯化
• 3.5 mRNA反转录第一链cDNA SMART cDNA
• 3.6 LD-PCR扩增SMART ds cDNA
• 3.7 回收ds cDNA
• 第二节 构建酵母单杂交体系
• 1 实验材料
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂器材及来源
• 1.4 主要溶液配制
• 1.5 引物
• 2 实验方法
• 2.1 构建酵母单杂交体系主要步骤
• 2.2 构建含有核糖体蛋白L32-1和L32-1启动子序列的pAbAi质粒
• 2.3 构建诱饵菌株,即将含有启动子的载体（pBait-AbAi）转化到Y1HGold中
• 2.4 检测含有诱饵质粒的Y1HGold中,AbAr的表达量
• 2.5 构建完整的酵母单杂交体系
• 2.6 文库滴度
• 2.7 挑选阳性克隆提酵母质粒并测序
• 2.8 验证结果正确性
• 2.9 RPL5的克隆及验证
• 3 结果
• 3.1 L32启动子诱饵质粒的构建与鉴定
• 3.2 双酶切验证阳性克隆
• 3.3 验证诱饵菌株,即诱饵载体（pBait-AbAi）是否转化至Y1HGold
• 3.4 检测Y1HGold/pAbAi/L32-1和Y1HGold/pAbAi/L32-2的AbAr本底表达量
• 3.5 酵母CDNA文库的构建及检定
• 3.6 酵母L32-1、L32-2启动子结合蛋白的筛选与鉴定
• 3.7 结果的重复验证
• 3.8 RPL5的克隆及验证
• 第三节 本章小结
• 参考文献
• 致谢