病理状态下庆大霉素肠道和膀胱透膜吸收及毒性研究

论文摘要

庆大霉素（GTM）为氨基糖苷类抗生素,具有广谱抗菌活性,其抗菌谱包括大肠埃希杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性杆菌,金黄色葡萄球菌（甲氧西林敏感,MSSA）等革兰氏阳性球菌；但与此同时具有耳肾毒性等严重的不良反应。由于GTM口服吸收率差,在消化内科及儿科被广泛地以肠道给药形式治疗慢性胃炎、急性腹泻及溃疡性结肠炎。目前普遍认为GTM口服给药安全,但通过调研文献发现其可以造成耳肾毒性。此外GTM膀胱冲洗于国内外被广泛地用于治疗或预防尿路感染,其安全有待考察。本课题欲通过细胞、动物及人三个层次系统地评价GTM肠道给药及膀胱冲洗的吸收及安全性,并探索其口服给药吸收机制。1.GTM在肠道病理状态下口服给药体外吸收研究Caco-2细胞来源于人结肠癌细胞,培养21d后可以分化成肠道上皮细胞,因此被广泛地用于研究口服药物体外吸收。脂多糖（LPS）可以刺激Caco-2细胞单层诱导产生炎症因子,进而模拟体外炎症性肠病（IBDs）.本实验通过以LPS刺激Caco-2细胞单层建立体外肠炎模型,进行GTM在正常Caco-2细胞单层和Caco-2细胞炎症模型下的跨膜研究。以CCK-8为指示剂进行细胞毒性实验,确定了GTM跨膜转运实验的浓度为200μg/ml,LPS浓度为5μg/ml o以ELISA法测定GTM跨膜转运的量,计算表观渗透系数Pappo发现GTM在正常Caco-2单层和LPS诱导的Caco-2细胞炎症模型上的Papp分别为0.823+0.06x10-6cm／s、0.884±0.05×10-6cm/s,P>0.05，说明体外肠道炎症状态下GTM吸收无明显增加。2.GTM在肠道病理状态下经肠道给药体内吸收研究研究本部分实验从三方面进行,即：①以1ml10%乙酸结肠内直接灌注构建大鼠急性结肠炎模型,以肉眼观察组织变化及HE染色评价结肠病理改变。造模成功后,给以GTM 16.8mg/kg灌胃,并于给药后20,30,60,90,120,180,360,720min经静脉窦抽取500μ1血液,采用荧光偏振免疫法（FPIA）测定GTM血药浓度,以DAS2.0药动学软件处理,求算药动学参数。结果表明正常组AUC、MRT.t1/2、Cmax分别为100.61±26.378mg/L·min,150.28±9.285min, 157.971±36.026min,0.47±0.12mg/L;模型组为123.34±16.521mg/L-min, 145.559±9.906min,168.376±43.528 min,0.59±0.08mg/L;各参数组间比较P>0.05,提示GTM灌胃在正常和急性结肠炎大鼠中药代动力学未发生显著性变化；②为进一步考察GTM口服安全性,对正常组大鼠进行了药物蓄积考察。通过以8.4mg/kg,bid连续给药10d,发现给药5d的血药浓度为0.31±0.08μg/ml,10d为0.32±0.07μg/ml,P>0.05,说明在给药期间GTM未出现蓄积；③于消化内科收集接受GTM灌肠的溃疡性结肠炎患者60min血液,发现血药浓度均<2μg／ml中毒谷浓度,且患者用药期间未诉任何不适及听力变化。综上所述,庆大霉素肠道给药是安全的。3.GTM膀胱冲洗吸收给药吸收考察本部分实验从动物和临床两方面进行。①大鼠腹腔注射140mg/kg环磷酰胺（CTX）构建出血性膀胱炎,HE染色观察造模结果。造模成功后,8.4mg/kg膀胱内注射GTM,给药后30min经颈静脉窦抽取500μ1血液,FPIA法测定血药浓度。结果表明模型组大鼠平均血药浓度为7.53±1.32μg/ml,明显高于对照组0.63±0.12μg/ml, P＜0.01;②于肾脏内科收集GTM膀胱冲洗患者给药后30min的血液,测得所有患者血药浓度均<2nμg/ml中毒谷浓度。综上所述,GTM膀胱冲洗用于单纯细菌性膀胱炎是安全的,但应避免用于出血性膀胱炎患者。4.GTM在Caco-2细胞模型中转运机制研究Caco-2细胞分化成熟后含有小肠刷状缘上皮相关的各种酶系以及药物转运蛋白,因此被广泛地用于探索口服药物的吸收机制。其中P糖蛋白（P-gp）,多药耐药蛋白2（MRP2），乳腺癌耐药蛋白（BCRP）是ABC族蛋白中研究最多的外排蛋白,且都能在Caco-2细胞单层的AP侧表达。本实验通过加入P-gp,MRP2,BCRP外排蛋白抑制剂及EGTA钙离子络合剂破坏细胞紧密连接探索GTM跨膜转运的机制。研究发现20μM维拉帕米、100μM丙磺舒可以分别使GTM的表观渗透系数增加3.50倍和2.44倍,P<0.01；而25μM双嘧达莫对GTM AP侧至BL侧的表观渗透系数没有影响,P>0.05;2.5mM EGTA可以使表观渗透系数增加4.97倍,P<0.01。结果表明GTM可能经细胞旁路途径吸收为主,同时也受到P-gp和MRP2外排泵的外排作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 1.概述
• 2.Caco-2细胞模型
• 3.本课题的切入点
• 附图
• 第一部分 GTM在肠道病理状态下口服给药体外吸收研究
• 1. 材料与仪器
• 1.1 材料和试剂
• 1.2 仪器及耗材
• 1.3 溶液配制
• 2. 方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 Caco-2细胞模型建立
• 2.3 细胞模型完整性评价
• 2.4 细胞毒性实验
• 2.5 GTM在Caco-2细胞上的转运实验
• 2.6 GTM在LPS诱导的Caco-2细胞IBDs模型下转运实验
• 2.7 GTM浓度测定
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 本章小结
• 第二部分 GTM在肠道病理状态下经肠道给药体内吸收研究
• 1. 材料、仪器与动物
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 2. 方法
• 2.1 动物模型建立
• 2.2 HE染色石蜡切片法
• 2.3 GTM单剂量口服给药药代动力学考察
• 2.4 GTM多剂量口服给药体内蓄积实验
• 2.5 临床实验
• 2.6 GTM血药浓度测定
• 2.7 统计分析
• 2.8 伦理学
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 本章小结
• 第三部分 GTM膀胱冲洗给药吸收考察
• 1. 材料、仪器与动物
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 2. 方法
• 2.1 动物模型建立
• 2.2 HE染色石蜡切片法
• 2.3 大鼠膀胱内注射GTM血药浓度考察
• 2.4 临床实验
• 2.5 统计分析
• 2.6 伦理学
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 本章小结
• 第四部分 GTM在Caco-2细胞模型中转运机制研究
• 1. 实验材料与仪器
• 1.1 材料和试剂
• 1.2 仪器及耗材
• 1.3 溶液配制
• 2. 方法
• 2.1 Caco-2细胞培养、模型建立及细胞单层验证
• 2.2 蛋白抑制剂对GTM转运影响
• 2.3 EGTA对GTM跨膜转运的影响
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 本章小结
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文及参编书籍
• 学位论文评阅及答辩情况表