芽孢杆菌yczE基因生防功能分析及表达Harpin蛋白的工程菌防病效果研究

论文摘要

芽孢杆菌（Bacillus spp.）是一种嗜热、好氧的G+杆状细菌。该菌分布广泛,能产生抗逆性强的芽孢,还能产生多种抗生素和酶类物质,是目前生防细菌中研究和应用较多的一类细菌。芽孢杆菌产生抗菌物质包括脂肽类、聚酮类、肽类、磷脂类和多烯类等。其中,通过非核糖体途径合成的脂肽类化合物占芽孢杆菌抗菌物质的绝大部分。脂肽类化合物包括表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（Iturins）和泛革素（fengycin）三大家族。分析脂肽类抗生素合成酶基因簇附近的遗传区,发现该区域的sfp和yczE基因最为保守。其中sfp基因编码的4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（4’-phosphopantetheinyl transferase）,是脂肽类抗生素合成的关键酶,而yczE基因功能未知。本研究旨在采用构建突变体的方法,分析yczE基因的功能。本研究运用同源双交换突变技术,成功突变OKB105和FZB42菌株的yczE基因。脂肽类化合物具有溶血和抑菌的活性,通过溶血和抑菌活性的检测,并结合脂肽类化合物的质谱分析表明,yczE基因的缺失对脂肽类化合物的合成没有影响。突变体OKB105ΔyczE和FZB42ΔyczE的促生实验表明,这两株突变菌株的促生效果与其亲本菌株没有显著差异,这表明yczE基因的缺失对两株菌株的促生活性没有影响。群聚运动（Swarming）对芽孢杆菌生物膜以及定殖在植物根部至关重要。Swarming活性检测表明,OKB105菌株swarming能力相比FZB42弱,yczE基因对FZB42菌株的swarming能力影响较大。通过定时统计swarming运动半径的深入研究表明,从4h开始,FZB42AyczE的swarming明显慢于其野生菌FZB42,在6h时,这种趋势更加显著。此时对swarming最边缘细胞进行电镜观察表明：突变体细胞排列更加疏松而且其鞭毛的数目要远远少于野生菌FZB42。生物膜的检测表明,FZB42ΔyczE的生物膜没有野生型的皱褶、致密而且更容易破碎。本研究采用荧光定量PCR方法揭示yczE基因影响swarming能力的分子机制。本文选择了swrA、flgB、efp、srfA和cheB这五个与swarming和定殖都密切相关的基因作为检测标志基因。在OKB105菌株中,由于缺失swrA基因,其swarming运动能力能力明显弱于FZB42菌株。6h的样品分析表明,突变体FZB42ΔyczE的swrA、flgB和efp基因的表达量相比FZB42菌株分别下降了2.58倍、6.176倍和12.832倍。Swarm细胞的鞭毛对于其swarming运动能力至关重要,因此yczE通过调控swrA、flgB和efp这三个鞭毛合成相关基因表达量,从而影响芽孢杆菌的swarming运动能力。本文还通过温室和田间实验,评估了OKBHF和FZBHarpin基因工程菌株的防病和促生效果,这两株基因工程菌能表达Harpin蛋白激发子。结果表明,OKB105、FZB42、OKBHF和FZBHarpin防治水稻白叶枯病的温室防效分别为31.7%、23.6%、43.2%和56.7%；田间防效分别为29.8%、21.8%、40.4%和43.1%。这说明表达Harpin蛋白的芽孢杆菌工程菌的防病效果显著高于出发菌株。促生效果检测表明,两株生防芽孢杆菌及其工程菌对水稻均有良好的促生作用,其中FZBHarpin促生作用最明显,达15.86%。田间产量统计结果显示,OKBHF增产效果最显著,达为14%。综合分析,工程菌比出发菌株能显著提高水稻抗病性和促进植物生长,在农业生产上具有应用的潜力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 脂肽类化合物结构及其生防活性
• 1 简介
• 2 CLPs的结构
• 3 脂肽类生物化合物的应用
• 3.1 脂肽类化合物在表面活性剂领域中的应用
• 3.2 抗病毒作用
• 3.3 用于防治植物病原菌
• 3.4 除去受污染土壤中的重金属离子
• 3.5 降解有害农药
• 3.6 发泡性能
• 3.7 微生物采油
• 4 Bacillus CLPs在植物病害生物防治中的作用
• 4.1 参与根部定殖
• 4.2 参与的直接对抗
• 4.3 脂肽类化合物诱导植物系统抗病性
• 4.3.1 植物体内CLPs诱导的防卫相关反应
• 4.3.2 CLPs诱导不同植物获得抗病活性
• 4.4 CLPs的生态学意义
• 5 在生物防治中Bacillus产生的其他一些抗生素
• 6 总结和展望
• 第二章 Swarming:一种协调一致的细菌活动
• 1 swarming研究概况
• 2 Swarming现象的三个阶段
• 2.1 营养细胞向swarm细胞的分化
• 2.2 Swarm细胞群体的迁移
• 2.3 Consolidation过程
• 3 调控swarming的两个关键系统
• 3.1 发展的途径:鞭毛操纵和细胞分化
• 3.2 生物合成途径:群体感应系统
• 4 Swarm细胞的特性
• 5 影响swarming产生的因素
• 5.1 鞭毛的影响
• 5.1.1 鞭毛的基本形态与结构
• 5.1.2 鞭毛的基因与合成的基因控制
• 5.1.3 细菌的运动及其机制
• 5.2 分泌黏液的影响
• 5.3 趋化系统的作用
• 5.3.1 负趋化的理论支持的证据
• 5.3.2 负趋化的理论的限制
• 6 Swarming的生物学意义
• 下篇 研究内容
• 第一章 芽孢杆菌yczE基因生防功能分析
• 第一节 yczE基因突变菌株的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株和培养基
• 1.2 酶和引物合成
• 1.3 定点突变枯草芽孢杆菌OKB105中的yczE基因
• 1.3.1 芽孢杆菌基因组的提取
• 1.3.2 扩增基因片段
• 1.3.3 TA克隆连接反应
• 2法）'>1.3.4 大肠杆菌感受态的制备（CaCl₂法）
• 1.3.5 连接产物的转化
• 1.3.6 菌落PCR筛选阳性克隆
• 1.3.7 质粒的提取
• 1.3.8 酶切反应体系
• 1.3.9 连接反应体系
• 1.3.10 连接产物的转化和验证
• 1.3.11 转化枯草芽孢杆菌OKB105
• 1.3.12 枯草芽孢杆菌转化子的验证
• 1.4 定点突变解淀粉芽孢杆菌FZB42菌株中的yczE基因
• 2 结果与分析
• 2.1 构建yczE基因突变体
• 3 讨论
• 第二节 野生菌与yczE基因突变体菌株表型实验分析
• 1 材料与方法
• 1.1 生物材料
• 1.2 培养基
• 1.3 平板对峙试验
• 1.4 血琼平板溶血试验
• 1.5 实验室烟草促生试验
• 1.6 swarming试验
• 2 结果与分析
• 2.1 平板对峙试验结果
• 2.2 血琼脂平板溶血试验结果
• 2.3 烟草根系生效果
• 2.4 swarming试验结果
• 3 讨论
• 第二章 FZB42与FZB42△yczE swarming现象研究
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株
• 1.2 酶和引物合成
• 1.3 培养基
• 1.4 swarming扩展分析
• 1.5 电镜观察
• 1.6 生物膜的形成能力
• 1.7 Realtime-PCR分析
• 1.7.1 芽孢杆菌RNA的提取
• 1.7.2 RNA反转录成cDNA和PCR检测
• 1.7.3 Quantiative RT-PCR（qRT-PCR）
• 2 结果与分析
• 2.1 swarm扩展半径测量
• 2.2 菌体鞭毛数和细胞排列情况观察
• 2.3 生物膜形成
• 2.4 qRT-PCR
• 3 讨论
• 第三章 表达Harpin蛋白的芽孢杆菌工程菌防治水稻白叶枯病的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料、供试菌株和培养基
• 1.2 芽孢杆菌的发酵
• 1.3 平板对峙试验
• 1.4 温室生防及促生试验
• 1.5 滁州大田生防试验
• 1.6 江宁大田促生试验
• 1.7 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 平板对峙试验结果
• 2.2 芽孢杆菌防治水稻白叶枯效果
• 2.3 芽孢杆菌对水稻促生效果
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文