菌寄生真菌纤细齿梗孢蛋白酶基因克隆与表达

论文摘要

生物之间的相互识别及信号传导一直以来都是生命科学研究的重要领域。菌寄生真菌与其寄主之间的相互作用是自然界普遍存在的一种生命现象。我们可以通过研究菌寄生真菌与寄主之间的相互作用来揭示生物之间的相互作用的分子机制。纤细齿梗孢（Olpitrichum tenellum）是一种活体营养接触型菌寄生真菌,其寄主包括Fusarium moniliforme, Alternaria alternata等。我们实验室一直在努力以其为基础研究菌寄生真菌与寄主真菌之间的相互作用的分子机制。细胞壁是细胞和细胞之间相互作用的第一道屏障,细胞壁蛋白研究已经成为生物间相互识别机制研究的热点。近年来,菌寄生真菌蛋白酶在菌寄生过程中的作用被人们逐渐重视起来。克隆和表达菌寄生真菌的蛋白酶编码基因变得很有意义。丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶。在生物体中丝氨酸蛋白酶超家族成员执行多种多样的生理功能,在很多致病过程以及细胞内的信号转导等方面起着重要作用。通过分析丝状真菌丝氨酸蛋白酶氨基酸序列,我们发现丝状真菌丝氨酸蛋白酶催化区的氨基酸序列非常保守。根据丝状真菌丝氨酸蛋白酶的同源保守序列设计兼并引物,通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端（RACE）的方法,克隆了该蛋白酶的编码基因mppro,全长cDNA包含3’、5’非编码区为2024bp,包含一个1554bp的ORF,编码517个氨基酸,该基因在GenBank中注册的登记号为EU368754。通过生物信息学的方法对获得的蛋白酶的编码基因mppro的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行了序列分析,通过分析发现mppro编码的蛋白是一种分泌型的丝氨酸蛋白酶,它属于与丝氨酸蛋白酶S8家族的枯草杆菌蛋白酶subtilisin,具有典型的信号肽-前肽-成熟肽的结构,并且和菌寄生真菌较多的木霉属真菌丝氨酸蛋白酶相似性很高,这可能是因为其都为菌寄生真菌有关。将经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的mppro基因和原核表达载体pET-22b（+）进行连接,构建成原核表达载体pET/mppro,并转化大肠杆菌E. coli BL21。经IPTG诱导培养45h,目的蛋白得到大量表达,SDS-PAGE电泳检测,在约31kDa处有一条明显的蛋白带;而空质粒pET-22b（+）转化BL21经诱导培养后无相应蛋白产生。原核表达后的蛋白没有活性,可能由于表达的蛋白以包涵体形式出现。mppro基因和酵母分泌型表达载体pPIC9K双酶切后体外连接,构建酵母重组表达载体pPIC9K/mppro并测序,保证正确的阅读框。将重组表达质粒pPIC9K/mppro和pPIC9K空质粒分别用限制性内切酶XbaⅠ（位于HIS4区内）线性化后,采用电击法转化Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞,于MD/MM平板上筛选His+Mut+表型的酵母转化子。经过PCR检测筛选整合子,进行甲醇诱导培养,甲醇诱导5d酶活性达到最高,达153U/mL。SDS-PAGE电泳检测,在约39kDa处有一条明显的蛋白带,蛋白大小与从该蛋白酶氨基酸序列估计的蛋白分子量相符;对转化子遗传稳定性进行了测定。对表达的蛋白产物进行了纯化并测定表达蛋白酶的酶学性质。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1. 菌寄生真菌与菌寄生作用的研究进展
• 1.1 菌寄生真菌的类型及其寄生性
• 1.2 菌寄生真菌和寄主之间的相互识别
• 1.2.1 相互识别机制
• 1.2.2 识别信号的传导
• 1.3 菌寄生真菌和寄主之间识别后的相互作用
• 1.3.1 菌寄生真菌和寄主之间相互作用中二者的形态变化及生理反应
• 1.3.2 菌寄生真菌和寄主之间相互作用的分子调控
• 1.3.3 菌寄生真菌和寄主之间相互作用产生的水解酶
• 1.4 菌寄生真菌研究展望
• 2 蛋白酶的研究进展
• 2.1 蛋白酶的分类
• 2.2 蛋白酶的生理功能
• 2.3 微生物蛋白酶基因的克隆表达情况
• 3. 巴斯德毕赤酵母表达系统
• 3.1 毕赤酵母表达宿主菌
• 3.2 常用表达载体
• 3.3 外源蛋白在毕赤酵母中的表达
• 3.3.1 外源蛋白在酵母中表达的一般步骤
• 3.3.2 毕赤酵母的转化方法
• 3.3.3 外源基因的整合方式
• 3.3.4 表达产物的翻译后加工与修饰
• 3.4 毕赤酵母表达的缺陷和对策
• 4 本研究的立题依据研究内容及意义
• 4.1 目的意义
• 4.2 研究内容
• 4.3 技术路线
• 第二章 纤细齿梗孢蛋白酶基因cDNA 序列的克隆及其序列分析
• 1. 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 菌株与质粒
• 1.1.3 酶和生化试剂
• 1.1.4 仪器
• 1.1.5 培养基
• 1.1.6 溶液配制
• 1.1.7 使用的PCR 引物
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 总RNA 的提取（ Trizol 法）
• 1.2.2 紫外检测RNA 产率和纯度
• 1.2.3 反转录cDNA 第一链的合成
• 1.2.4 目的基因cDNA 中间片段的分离
• 1.2.5 目的基因3’末端的分离（3’-RACE）
• 1.2.6 目的基因5’末端的分离（5’-RACE）
• 1.2.7 目的基因全长 cDNA 的克隆
• 1.2.8 全长序列的生物信息学分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 兼并引物的设计
• 2.2 菌寄生真菌总 RNA 的提取
• 2.3 纤细齿梗孢蛋白酶中间片段的分离
• 2.4 Olpitrichum tenellum 蛋白酶基因3’-末端cDNA 的分离
• 2.5 Olpitrichum tenellum 蛋白酶基因5’-末端cDNA 的分离
• 2.6 Olpitrichum tenellum蛋白酶基因全长cDNA的分离及扩增片段的序列拼接
• 2.7 蛋白酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析
• 2.7.1 纤细齿梗孢蛋白酶编码基因的cDNA 序列分析
• 2.7.2 蛋白酶基因mpprp 的氨基酸序列分析
• 2.7.3 蛋白酶基因mppro 的结构域分析
• 2.7.4 蛋白酶转运分析
• 2.7.5 蛋白酶基因mppro 结构及加工后的修饰分析
• 2.7.6 蛋白酶基因mppro 相似性分析
• 3 讨论
• 3.1 纤细齿梗孢Olpitrichum tenellum 总RNA 的提取
• 3.2 纤细齿梗孢蛋白酶基因的结构特点
• 3.3 本章小结
• 第三章 Olpitrichum tenellum 蛋白酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 酶和生化试剂
• 1.1.3 培养基及有关溶液的配制
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 蛋白酶前肽及成熟肽基因序列的分离
• 1.2.2 蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达
• 1.2.3 蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达
• 2 结果与分析
• 2.1 蛋白酶mppro 表达基因序列的限制性酶切位点分析结果
• 2.2 表达序列的获得
• 2.3 纤细齿梗孢蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达
• 2.3.1 蛋白酶基因原核表达载体的构建
• 2.3.2 蛋白酶基因原核表达菌株BL21-mppro 的构建
• 2.3.3 蛋白酶基因的原核诱导表达
• 2.3.4 原核表达的蛋白酶活性测定
• 2.4 纤细齿梗孢蛋白酶基因mppro 在毕赤酵母中的表达
• 2.4.1 酵母表达载体的构建和鉴定
• 2.4.2 pPIC9K
• 2.4.3 表达蛋白酶的纯化
• 2.4.4 表达蛋白酶酶学性质的研究
• 2.4.5 表达蛋白酶的遗传稳定性的研究
• 3. 讨论
• 3.1 关于纤细齿梗孢蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达
• 3.2 关于本研究线性化表达载体线性化所用的酶
• 3.3 毕赤酵母自身分泌的蛋白酶对本研究表达的影响及消除措施
• 3.4 本章小结
• 第五章 全文总结和展望
• 1. 全文总结
• 2. 展望
• 参考文献
• 致谢