论文摘要
生活节奏的加快、空间的扩展以及交通事故的频发等因素,使骨组织损伤、骨折的发生率逐年上升,加之骨肿瘤、感染等多种原因导致的骨缺损的修复一直是骨科临床工作中普遍存在并亟待解决的一大难题。目前临床上应用最广泛的主要治疗方法有自体骨移植、异体骨移植。但两种方法都有一些无法避免的局限性和缺点：如自体骨移植的来源有限、增加供体部位感染机率、引起取骨部位的创伤、延长手术时间等缺点；而异体骨移植有可能传播疾病、宿主免疫排斥反应等。为避免或减少上述问题,应用组织工程方法构建人工骨修复材料为骨缺损的修复提供了希望和可能,寻找一种合适的人工骨缺损修复材料是近年来骨组织工程的研究热点。骨组织工程研究中种子细胞和支架材料是最的两大因素,支架为细胞粘附生长提供可附着的基础,支架需要有效的支持种子细胞的粘附、生长、分化,另外支架材料还具有一定细胞外基质功能及适时降解性,二者是相辅相成的。骨髓间充质干细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）作为骨组织工程的种子细胞是目前众多种子细胞中研究最多的细胞。BMSCs具有多分化潜能,在特定条件下能向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等分化,增殖能力强,来源广泛,取材方便,供区损伤小,因而倍受人们的关注。对骨髓间充质干细胞的细胞周期的研究表明,大约有20%的骨髓间充质干细胞处于静止期,即GO期,这表明骨髓间充质干细胞具有强大的增殖能力。研究表明骨髓间充质干细胞体外培养12代仍能保持正常的染色体表型和端粒酶活性,在培养了15代之后仍保持其成骨的分化潜能。组织工程人工骨不仅需要成骨能力强的种子细胞,更需要适宜的人工细胞外基质（即细胞载体）材料。由于骨组织的特殊生理结构和力学性能,对骨组织工程细胞外基质材料有特殊要求,理想的骨组织工程支架材料应具备以下条件：①有良好的生物相容性,有利于复合及周围细胞的粘附、增殖、无毒、不致畸,不引起炎症反应。②有效的表面活性,有利于细胞粘附、并为细胞在其表面生长、增殖和分泌基质提供良好的微环境,能激活细胞特异性基因表达,维持正常细胞的表型表达。③具有三维多孔结构,材料具有多空性和孔隙率,孔隙率最好在90%以上,内表面积大,既有利于细胞的粘附和长入,又利于营养成分代谢产物的排出。④一定的可塑性：便于加工成所需要的形状,并具有一定的机械强度,从而使所形成的组织具有所需的外形。⑤适宜的生物降解性：材料的降解速率应与组织细胞的生长速率相适应,应能根据组织生长特性逐步降解。生物类材料中的同种异体骨和异种骨两者都存在免疫原性问题,及降解过快等缺点。生物陶瓷类材料磷酸三钙（TCP）、生物活性玻璃陶瓷（BGC）、双相钙磷陶瓷（HA/TCP）为代表,具有良好的成骨能力,但存在脆性大、降解慢等缺陷,影响新生骨替代进程和骨组织后期改建。有机材料有着良好的生物相容性、可降解性可吸收性、材料的吸收率可控制等优点,但亲水性差,细胞吸附力较弱,材料表面缺乏细胞识别信号,与细胞间缺乏生物性相互作用,聚合物中残留的有机溶剂可引起细胞毒副作用：天然材料生物相容性好,具有细胞识别信号,利于细胞黏附增殖；人工材料缺乏细胞信号,但具有天然材料所不足的可以大规模生产、可以设计和控制结构、机械性能和降解时间等优点。可见,单一类型材料一般难以满足骨组织工程支架材料的要求,通过合适的方法将单一的生物陶瓷类与有机物材料结合,互相取长补短,形成复合型材料,在实际应用中取得了良好的效果。可注射性纳米羟基磷灰石／壳聚糖（nano-Hydroxyapatite/chitosan,nHA/CS）复合材料是具有良好骨传导、骨诱导性的纳米材料,最大的特点为高比表面积和空隙率,有利于细胞接种、迁移和增殖。因为贴壁依赖型细胞只有在材料上黏附后,才能生长和分化。其孔隙率90%,孔径50-300μm该材料具有较好的初始稳定性和强度,既可以原位成形固化,又可以塑形,研究表明其同时具备有羟基磷灰石的和壳聚糖的特性,经过前期的实验研究证实可注射性nHA/CS具有良好的生物相容性。骨髓间充质干细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）的成骨分化能力早已为人们熟知。本实验研究拟在体外培养BMSCs,并与nHA/CS复合培养,验证该复合材料的生物相容性基础上,制作兔股骨髁骨缺损动物模型,富集骨髓间充质干细胞与nHA/CS支架材料复合,对该复合物对促进骨缺损修复中的作用进行评估,为富集BMSCs-nHA/CS复合物在骨组织工程临床应用提供实验基础及可行性依据。研究内容：1、第一部分可注射性nHA/CS复合材料与骨髓间充质干细胞生物相容性研究。采用密度梯度离心法获得兔原代骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Stem Cells, BMSCs）,体外培养并将传至第3代的骨髓间充质干细胞与可注射性纳米羟基磷灰石／壳聚糖复合材料共同培养,观察细胞与该材料的生长增值情况及生物相容性。2、第二部分富集骨髓间充质干细胞复合nHA/CS修复兔骨缺损的实验研究。建立兔股骨髁上骨缺损模型,富集第3代骨髓间充干细胞,负压条件下将第3代BMSCs与nHA/CS材料复合,将富集BMSCs-nHA/CS复合物植入兔股骨髁上骨缺损内,术后不同时间点取材后大体、组织学观察该复合物对骨缺损的修复效果。研究方法：1、可注射性nHA/CS复合材料与骨髓间充质干细胞生物相容性实验方法：采用全骨髓穿刺法从3周龄健康新西兰大白兔股骨和胫骨骨髓中抽取原代兔骨髓,密度梯度离心法获取原代骨髓间充质干细胞,培养鉴定后,体外培养并将稳定的传至第3代,按一定浓度接种到纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料上,体外共同培养。倒置相差显微镜、电镜观察接种到材料上的细胞形态及细胞在材料上附着情况,CCK-8法测定细胞活性,并计数细胞接种后2、4、8、12h在材料表面的黏附状况。并对诱导培养后细胞进行碱性磷酸酶活性测定。采用SPSS13.0统计软件分析,结果用x±S表示,P-0.05为差异有统计学意义。同一时间点两组细胞粘附数采用两独立样本t检验；同组不同时间点应用多个样本均数比较的方差分析（One-way ANOVA）,组间多重比较采用LSD法。2、富集骨髓间充质干细胞复合nHA/CS修复兔骨缺损的实验方法：36只成年新西兰白兔,体重为1.5-2.0kg,按随机数字法随机分为3组：4周组、8周组、12周组（每组12只）。兔双侧股骨髁上建立直径为7mm,深度为10mm骨缺损空腔,将BMSCs-nHA/CS复合物植入右侧骨缺损作为实验组,左侧植入单纯nHA/CS材料作为对照组,其中每组中4只兔两侧骨缺损不植入任何材料作为空白对照组。分别于4、8、12周末取材观察：①大体观察材料植入后动物的生命活动状况,并观察标本骨缺损修复愈合状况；②X线、CT横断面扫描及三维重建进一步通过影像学对骨缺损愈合状况进行评估；③骨密度值测量比较实验组对照组的差异情况。④组织学切片观察骨缺损处与材料交界部位新生骨形成,材料降解及骨缺损愈合的组织学变化过程；研究结果：1、可注射性nHA/CS复合材料与骨髓间充质干细胞生物相容性实验结果：①倒置显微镜观察发现,骨髓间充质干细胞围绕在nHA/CS复合材料边缘生长,随着时间的递增,细胞数目逐渐增加,生长状况良好。②电镜检测发现骨髓间充质干细胞粘附在nHA/CS材料表面上生长良好,部分细胞伸出伪足长入材料孔隙里。③黏附数测定结果表明,细胞接种到纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料2h时两组比较差异有统计学意义（P=0.000）,材料组黏附数低于对照组；但接种4 h,8h,12h后两组比较差异无统计学意义（P=0.91、0.084、0.081）,材料组细胞粘附数与对照组相比差异无统计学意义。④CCK-8法测定细胞活性：细胞密度从最初培养到7天至平台期后达到最大。材料组和对照组在最初7天均呈相同的逐渐增长趋势,第7天时达到最大值。细胞和材料共同培养后增殖细胞没有明显改变,nHA/CS对细胞的生长及增值活性没有明显影响。2、富集骨髓间充质干细胞复合nHA/CS修复兔骨缺损的研究结果：所有实验兔术后2天后完全恢复正常饮食水。5天后手术切口均Ⅰ期愈合,兔活动状态如术前。观察期间兔下肢未出现感染现象。①大体观察：实验组：4周后尚可见缺损区域,纤维组织覆盖缺损区；8周后缺损区凹陷变平整,表面光滑,有光泽,按压移植部位可有部分阻抗；12周后骨缺损区域完全修复,股骨形状基本恢复到术前形态,按压移植部位阻抗与周边正常骨组织相似。对照组：4周后缺损区可见；8周后缺损区与周围界限变模糊,表面欠光滑,颜色稍暗,按压移植部位稍有阻抗；术后12周骨缺损区域与周围界限不能分辨,色泽与周围无明显差异,按压移植部位有一定的阻抗,但有部分骨皮质缺损,仅纤维组织填充。空白组：4周后缺损腔仍在,纤维结缔组织覆盖缺损；8周后缺损区见肉芽组织填充空腔,缺损区没有阻抗,按压即部分塌陷。12周缺损区见大量肉芽部分填充缺损修复效果差。②X线、CT检查结果：实验组：4周时材料与正常骨组织之间有一环状的界限,缺损仍可见；8周时正常骨组织与材料界限模糊,缺损区域透光性稍低于周围宿主骨组织,正常骨组织与材料界限模糊,外层骨皮质已有连接；12周末组骨缺损完全修复,原缺损空腔有新生骨组织,CT显示缺损修复区域与周围骨组织密度基本相同。对照组：4周时骨缺损区域仍可见,材料与周围组织之间界限尚清晰明显；8周时缺损区域较前明显减小,缺损区透光性低于周围宿主骨组织,但外层骨皮质不连续；12周时骨缺损较前进一步减小,骨缺损见部分骨性修复,仍有部分骨皮质不连续。空白组：4周缺损明显,未见愈合征象；8周后缺损空腔见纤维组织填充,见肉芽组织填充缺损,未见骨性组织填充；12周时缺损边缘见硬化,缺损空腔密度明显低于骨周围组织密度,未见明显骨性成分修复。③12周时CT三维重建：实验组：骨缺损已基本完全修复,未见明显骨缺损空腔；对照组有部分新骨长入,但缺损空腔仍可见,缺损空腔仍存在；空白组修复效果最差,骨缺损空腔明显存在。④骨密度值测量：随时间增加,各组骨密度值逐渐增加,4周、8周、12周末时实验组与对照组及空白组比较骨密度值差异有统计学意义（P<0.05）,在各个时间点实验组骨密度值均大于对照组和空白组,方差分析比较差异有统计学意义（P<0.05）,实验组骨密度值高于对照组及空白组。⑤组织形态学观察：实验组：4周时复合材料与宿主骨交界有少量新骨形成,有纤维骨痂形成,材料与骨组织生物相容性好；8周时出现大量排列较整齐的新生骨小梁,可见成骨细胞生长,并可见少量板层状样骨组织,材料有部分降解；12周时可见大量新生板层骨组织,见成骨细胞较多,大量新骨原缺损区被新生板层骨组织填充,材料大部分降解。对照组：4周时纤维软组织长入材料,缺损边缘可见少量纤维性骨痂形成；8周后,缺损区有新生成骨细胞,未见板层骨形成,材料部分降解；12周后少量板层样骨组织形成,但仍有部分骨缺损区域由纤维组织填充,材料亦大部分降解。空白组：4周时纤维软组织长入材料,也可见淋巴细胞等,缺损边缘可见少量纤维骨痂形成；8周后见边缘有少量成骨细胞,纤维结缔组织长满空腔；12周时见有纤维肉芽组织形成,但缺损中心区域未见成骨细胞形成。结论：①骨髓间充质干细胞在可注射nHA/CS材料上正常生长、增殖、分化,体外实验表明该材料对细胞无毒性,具有良好的生物相容性。②富集BMSCs-nHA/CS对兔股骨骨缺损修复效果较单纯nHA/CS凝胶材料好,而后者又优于空白组,单纯nHA/CS材料组修复效果优于空白组,说明nHA/CS材料参与了骨的修复；细胞支架复合体组的修复效果优于支架组和空白组,说明体外扩增的BMSCs在修复中的作用占主导,可能起了重要作用。nHA/CS作为良好的骨组织工程材料具有良好的组织相容性及骨传导性,因此采用富集BMSCs-nHA/CS修复骨缺损具有效果可靠,经济等优点,具有良好的应用前景。
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相关论文文献
- [1].新型可注射性nHA/CS骨修复材料修复兔股骨髁骨缺损的X线评估[J]. 中国矫形外科杂志 2011(17)