MASPIN真核表达载体的构建及对胃癌细胞SGC7901凋亡与增殖的影响

论文摘要

目的:1.构建MASPIN基因真核表达载体,转染至胃癌细胞株SGC7901,检测其对SGC7901细胞MASPIN表达的影响。2.检测转染MASPIN对胃癌细胞SGC7901细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。3.检测凋亡相关基因Bax/Bcl-2基因表达变化,探讨过表达MASPIN诱导胃癌细胞凋亡的机制。方法:1.RT-PCR扩增MASPIN基因全长,载体PCR2.1用HindⅢ/XbaI双酶切,二者用T4连接酶构建MASPIN/PCR2.1表达载体,转染胃癌细胞株SGC7901。2.琼脂糖凝胶电泳检测凋亡特征性DNA梯形带.3.采用AnnexinV-FIFC/PI方法检测转染前后﹑使用凋亡诱导剂TRATL（50ng/ml）前后凋亡率变化。4.RT-PCR和Western bolt检测MASPIN基因、Bax/Bcl-2基因表达变化。5.采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法和流式细胞术（FCM）,检测过表达MASPIN对SGC7901细胞增殖及细胞周期的影响。结果:1.酶切证实成功构建真核表达质粒MASPIN/PCR2.1;转染重组质粒组MASPIN mRNA（33.62±1.2）和蛋白水平（23.36±1.6）的表达明显高于未处理组（13.72±2.0、12.01±1.3）和空质粒组（15.01±1.5、12.32±1.5, P<0.05）。2.凝胶电泳观察到特征性凋亡梯带。3.各组细胞均有凋亡率的增加且呈时间依赖性:转染重组质粒/TRAIL作用组最高,12h、24h、48h分别达到8.0%、16.3%、25.8%,转染重组质粒组为3.0%、8.2%、14.4%,TRAIL作用组为4.1%、9.8%、15.9%（P<0.05）。4.48h转染重组质粒?TRAIL组Bax mRNA和蛋白表达（55.32±1.4、75.38±1.3）高于转染重组质粒组（34.32±1.2、40.67±1.8）和TRAIL作用组（43.25±1.8、36.18±1.3,P<0.05）;三组Bcl-2 mRNA表达为28.33±2.5、34.31±1.2、32.84±2.1（P<0.05）,蛋白表达为17.43±1.5、45.11±2.1、42.84±1.5（P<0.05）。5.流式细胞仪检测显示和与转染空载体组相比,过表达MASPIN的SGC7901细胞G0/G1期百分比增高（70.3%vs55.6%）,S期细胞减少（19.8% vs 34.9%,P<0.05）。6.MTT实验显示,转染MASPIN/PCR2.1组细胞增殖随时间延长而减慢,第12h、24h、48h、72h的细胞增殖率分别为0.98%、6.93%、18.03%和33.5%,明显低于转染空载体组0.04%、3.01%、4.21%、4.41%（P<0.05）。结论:1.成功构建MASPIN/PCR2.1表达载体。转染胃癌细胞株SGC7901后上调了MASIPIN基因在mRNA和蛋白水平表达。4.过表达MASPIN能诱导SGC7901细胞发生凋亡并显著增加胃癌细胞对凋亡刺激信号的敏感性,时间越长效应越显著。其机制可能通过上调Bax,下调Bcl-2基因的表达诱导胃癌细胞凋亡。5.过表达MASPIN能诱导SGC7901细胞发生增殖抑制和G0/G1期阻滞。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
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• 英文摘要
• 论文正文：MASPIN 真核表达载体的构建及对胃癌细胞SGC7901 凋亡与增殖的影响
• 前言
• 1 材料和方法
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 附图
• 参考文献
• 综述文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录