小尾寒羊骨骼肌细胞Myostatin基因打靶的研究

论文题目: 小尾寒羊骨骼肌细胞Myostatin基因打靶的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生理学

作者: 张蕾

导师: 陈永福

关键词: 基因,基因打靶,转基因,骨骼肌细胞

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 基因打靶是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组,并整合在预定位点,而改变细胞遗传特性的方法。本研究探讨了在小尾寒羊骨骼肌细胞中进行myostatin基因的打靶,设计了两个无启动子打靶载体MSTN-GFP和MSTN-Neo,并转染原代胎儿和新生羊骨骼肌细胞,通过观察细胞的发光情况和药物筛选分离阳性细胞,利用PCR和Southern杂交方法验证阳性细胞克隆,结果显示总打靶效率为6×10-5。 肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）又称GDF-8（growth differentiation factor 8）,是肌肉生氏的负调控因子,是TGF-β（transforming growing factor）超家族的成员之一,Myostatin的主要功能是抑制肌肉的过度增生。中国小尾寒羊产子率和产肉率不能同步的缺点使我们想到利用基因打靶的方法下调myostatin基因活性而生产出同时具有产子率高和肌肉产量也高的绵羊品种。 利用Long-PCR的方法,从牛的基因组中成功得获得5.0kb和1.0kb的二段扩增产物。其中5.0kb片段位于MSTN基因的第一至第三外显子的前段,1.0kb片段位于MSTN基因的第三外显子后段和3’非翻译区部分片段。两个片段分别克隆于pMD-18T载体。测序结果表明克隆的两个片段均为绵羊MSTN基因的序列。两个片段中的部分4.6kb和0.8kb分别作为打靶载体的5’和3’同源臂,以载体pGEM-3Zf（-）为骨架,分别以Neo和GFP为标记基因,构建了无启动子打靶载体MSTN-Neo、MSTN-GFP,脂质体转染小尾寒羊骨骼肌细胞以敲除羊的MSTN基因。 取妊娠50天的小尾寒羊胎儿及新生1周的羊后腿伸肌,用胰蛋白酶消化法分离出骨骼肌细胞,经体外培养,传代,建立了骨骼肌细胞系。以建好的无启动子打靶载体为外源基因,AatⅡ线性化后采用脂质体转染骨骼肌细胞。 载体MSTN-GFP转染新生羊骨骼肌细胞后24小时观察细胞发光情况,平均每105受体细胞中有2～3个发出绿色荧光。 打靶载体MSTN-Neo,用脂质体转染小尾寒羊胎儿和新生羊骨骼肌细胞,分盘后48小时加入G418进行筛选6～10天,筛选过程中,在相同条件下在培养液中分别加入15%FCS和10%FCS进行比较研究,分离抗G418的单细胞克隆,共得到细胞克隆88个,分别扩大培养,部分冻存,部分提取基因组进行PCR检测和Southern杂交分析,结果分析表明确定1个细胞克隆的MSTN基因的一个等位基因被敲除。 本文研究了小尾寒绵羊MSTN基因片段的克隆、无启动子打靶载体的构建、小尾寒羊骨骼肌细胞的分离和体外培养以及打靶阳性细胞的制备和确证。利用打靶阳性细胞进行核移植的工作将进一步开展。

论文目录:

第一章 文献综述I Myostain基因的研究进展

1 Myostatin基因的结构性状

2 Myostatin的表达特异性

3 Myostatin的信号传导

4 调节肌肉生长发育的因子

4.1 肌肉调节因子家族

4.2 肌细胞增强因子2(MEF2)家族

4.3 其它肌肉调节蛋白及其相互作用

5 Myostatin的作用机理

6 Myostatin突变的研究进展

6.1 自然突变的研究进展

6.2 人为阻断Myostatin活性的研究进展

7 Myostatin其他生物学效应及在临床医疗中的价值的研究

第二章 文献综述Ⅱ 基因打靶技术的研究进展

1 基因打靶的原理

1.1 同源重组的概念

1.2 同源重组模型

2 基因打靶的策略及载体设计

3 影响基因打靶效率的因素

3.1 同源片段来源的影响

3.2 同源片段长度的影响

3.3 外源DNA导入方法的影响

3.4 靶基因位点的影响

4 体细胞打靶

4.1 体细胞核移植研究进展

4.2 体细胞打靶的策略

5 基因打靶在生物医学中的应用前景

5.1 基因打靶技术在基因功能研究中的应用

5.2 应用基因打靶技术研制人类疾病动物模型

5.3 应用基因打靶技术改良动物品系和研制动物反应器

第三章 无启动子打靶载体MSTN-Neo、MSTN-GFP的构建

1.材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 小尾寒羊基因组的提取

2.2 从基因组中PCR扩增产物MSTN5.0kb片段和1.0kb片段

2.3 PCR产物MSTN5.0kb片段和1.0kb片段的克隆

2.4 pMD18-T5.0、pMD18-T1.0克隆的测序结果及其分析

2.5 载体pGEM-3Zf-S的构建

2.6 载体pGEM-3Zf-Neo、pGEM-3Zf-GFP的构建

2.7 无启动子打靶载体MSTN-Neo、MSTN-GFP的构建

2.8 打靶载体线性化

3.讨论

第四章 小尾寒羊骨骼肌细胞系的建立

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 新生小尾寒羊及胎儿骨骼肌细胞的分离建系

2.2 骨骼肌细胞对G418毒性敏感性检测

2.3 骨骼肌细胞对G418筛选后形成克隆的能力性检测

2.4 脂质体转染骨骼肌细胞

3 讨论

3.1 小尾寒羊骨骼肌细胞的分离和建系

3.2 小尾寒羊骨骼肌细胞在培养过程中的形态和生长变化规律

第五章 小尾寒羊MSTN基因的敲除

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 抗G418细胞克隆的分离

2.2 观察MSTN-GFP载体转染后细胞发光情况

2.3 打靶载体MSTN-Neo定点整合的PCR检测

2.4 PCR阳性克隆的Southern Blotting分析

3 讨论

3.1 小尾寒羊骨骼肌细胞myostatin基因打靶的优势

3.2 绵羊myostatin基因打靶及其鉴定

结论

展望

参考文献

致谢

附录

作者简介

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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• [2].小尾寒羊多胎性状相关基因的鉴定和遗传研究[D]. 柳淑芳.山东农业大学2004
• [3].BMPR-IB基因和PGR基因作为小尾寒羊多胎候选基因的研究[D]. 张利平.甘肃农业大学2005
• [4].小尾寒羊5个与繁殖和疾病抗性相关基因的克隆及比较基因组学分析[D]. 宋雪梅.中国农业科学院2007
• [5].小尾寒羊子宫复旧的研究[D]. 曹荣峰.东北农业大学2002
• [6].新吉细毛羊和小尾寒羊的毛品质性状及皮肤转录组学研究[D]. 孙福亮.延边大学2016
• [7].集约化生产方式下无角陶赛特×小尾寒羊羔羊产肉性能和肉质的研究[D]. 杨开伦.新疆农业大学2009
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• [9].小尾寒羊妊娠中后期胎盘和子宫颈成熟的监测[D]. 葛利江.东北农业大学2003
• [10].杜寒杂交羊与小尾寒羊背最长肌全基因组甲基化与转录组比较分析[D]. 曹阳.吉林大学2017

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