论文摘要
背景:原发性肝癌在我国消化系统恶性肿瘤死亡率中居第三位,虽然随着肝癌治疗手段的进步,患者的总体生存率和生活质量有了大幅提高,但治疗后肿瘤复发和转移等难题仍难以避免。越来越多的研究证明,并非所有的肿瘤细胞都具有自我更新和无限增殖潜能,只有其中少量细胞亚群具有干细胞性质,能够无限增殖和自我更新,人们称之为肿瘤干细胞（tumor stem cells,CSCs）。肿瘤干细胞虽然含量极少,却决定着肿瘤的发生、发展、转移和复发,因此针对肝癌干细胞（liver cancer stem cells,LCSCs）的防治才是从源头上扼制肝癌的最佳途径,而肝癌干细胞的分离富集研究则成为肝癌干细胞研究的首要关键。一直以来,肝癌干细胞都缺乏有效的分离方法,目前的几种分选方法获得的肝癌干细胞数量极少,要求技术较高,代价昂贵,限制了临床上肝癌干细胞的使用研究。因此,寻找高效快捷可行的富集肝癌干细胞的方法,是肝癌基础及应用基础研究的当务之急。肿瘤干细胞学说认为:肿瘤干细胞可能与正常干细胞有相似之处,通常处于细胞分裂周期的G0/G1期,高表达耐药蛋白,较成熟细胞的化疗敏感性低。这些特性提示我们,也许可以使用化疗方法处理肝癌细胞,通过杀死对化疗敏感的绝大部分成熟肝癌细胞的手段,富集对化疗并不敏感的肝癌干细胞。目前已有研究报道,乳腺癌、肺癌、白血病等肿瘤干细胞可以通过化疗手段富集成功。那么肝癌干细胞是否也能够用同样原理进行化疗富集?在化疗药物刺激下,肝癌干细胞是否会一成不变?成熟肝癌细胞化疗中是否会演变成肝癌干细胞?对上述疑问,目前尚未见报道。因此我们设想,建立低剂量顺铂化疗富集肝癌干细胞模型,对于探讨肝癌干细胞起源及生物学特性具有重要的指导意义。目的:1.探讨肝癌干细胞化疗富集方法是否可行,以期解决肝癌干细胞研究中肝癌干细胞数量稀少的问题。2.比较不同化疗浓度、不同作用时间条件下,低剂量顺铂富集肝癌干细胞的效率,以期寻找到富集肝癌干细胞的最佳条件。3.通过肝癌干细胞富集效率差异性的比较,进一步从理论上探索肝癌干细胞可能的增殖及分化模式。方法:1.应用终浓度为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml的顺铂分别作用处于对数生长期的HepG2人肝癌细胞株24h、48h、72h,倒置显微镜下观察各化疗组与对照组细胞的形态。2.流式细胞仪检测各化疗组与对照组残存细胞肝癌干细胞表面标记物ALDH1、CD133表达。3.免疫荧光染色法检测各化疗组与对照组细胞肝癌干细胞表面标记物ALDH1、CD133表达。4. MTT法检测各化疗组与对照组细胞存活率。5. Western blot法检测化疗组与对照组ABCG2蛋白表达。结果:1. HepG2人肝癌细胞株化疗前后细胞形态学差异:对照组HepG2细胞呈长梭形,体积较大,突起较少,细胞轮廓清楚,排列紧密;化疗组细胞大部分悬浮于培养液中,皱缩呈球状,贴壁细胞密度明显下降,呈多边形或纺锤形,体积较小,突起增多。2.各化疗组与对照组细胞肝癌干细胞表面标记物ALDH1、CD133流式细胞仪检测结果:ALDH1+细胞对照组平均阳性率为（0.35±0.11）%,化疗组浓度1ug/ml（9.33±1.98）%,2ug/m（l11.31±3.21）%,3ug/m（l17.25±3.50）%,4ug/m（l20.41±0.97）%,5ug/ml（14.21±1.08）%,化疗各浓度组与对照组比较差异有统计学意义（p<0.05）,但3ug/ml组与5ug/ml组比较差异无统计学意义（p=0.846）,2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml各组相互比较差异有统计学意义（p<0.05）,4ug/ml与5ug/ml比较差异有统计学意义（p<0.05）。CD133+细胞在对照组的平均阳性率为（0.07±0.026）%,化疗组浓度1ug/ml（7.25±0.86）%,2ug/ml（8.43±0.64）%,3ug/ml（9.42±0.70）%,4ug/ml（13.28±0.70）%,5ug/ml（6.22±0.18）%,化疗各浓度组与对照组比较差异有统计学意义（p<0.05）,但2ug/ml组与3ug/ml组比较差异无统计学意义（p=0.22）,1ug/ml、3ug/ml、4ug/ml和5ug/ml各组相互比较差异有统计学意义（p<0.05）,4ug/ml与5ug/ml比较差异有统计学意义（p<0.05）以上数据均符合正态分布,采用多因素方差分析。3.各化疗组与对照组细胞肝癌干细胞表面标记物ALDH1、CD133免疫荧光染色检测结果:ALDH1对照组可见细胞胞浆及胞膜被染成暗绿色,染色较浅,化疗组可见部分细胞胞浆及胞膜被染成亮绿色,呈铺路石样特征,染色较深,即为ALDH1阳性细胞;CD133对照组可见细胞胞浆及胞膜被染成暗红色,染色较浅,化疗组可见部分细胞胞浆及胞膜被染成亮红色,呈铺路石样特征,染色较深,即为CD133阳性细胞。4. MTT法检测各化疗组与对照组残存细胞存活率的变化:随作用时间和化疗浓度变化,细胞存活率变化,但未呈现出正比例线性改变。5. Western blot法检测化疗组与对照组ABCG2蛋白的表达:化疗组在相对分子质量为70 000Da左右出现了ABCG2蛋白阳性表达目的条带,与未化疗组相比,化疗组的ABCG2蛋白表达更强,差异有统计学意义（p<0.05）。结论:1. HepG2肝癌细胞株体外化疗后, ALDH1、CD133、ABCG2阳性表达增加,提示化疗能富集肝癌干细胞。2.顺铂浓度<4ug/ml时,肝癌干细胞富集效率与顺铂浓度呈正相关,再增大浓度,肝癌干细胞富集效率反而降低。3.化疗后72小时内,随化疗时间延长,肝癌干细胞富集效率提高,呈线性正相关。