论文摘要
研究背景:骨肉瘤是最常见的高度恶性的原发性骨肿瘤,好发于青少年,死亡率高。目前骨肉瘤的主要治疗手段为手术辅助化疗。虽然病人的生存率已得到了显著的提高,但对于伴有转移的骨肉瘤目前仍无有效的治疗手段;化疗耐药和化疗后继发肿瘤也是骨肉瘤治疗过程中面临的难题。因此,寻找新的治疗方法仍是当前研究的热点。冬凌草甲素是从冬凌草等植物中提取出来的一种天然活性物质,具有抗炎、抗DNA突变、抗氧化作用。目前研究证明,冬凌草甲素对多种肿瘤具有生长抑制作用,有望成为一种高效、低毒的新型抗肿瘤药物。本研究用冬凌草甲素作用于人骨肉瘤细胞株——MG-63细胞株,观察冬凌草甲素对MG-63细胞是否具有抑制增殖、凋亡诱导和转移抑制作用,并对其分子机制进行部分揭示。第一章冬凌草甲素对MG-63细胞的增殖抑制效应目的:确定冬凌草甲素是否具有抑制MG-63细胞增殖的能力。方法:用不同浓度的冬凌草甲素干预MG-63细胞,通过台盼蓝拒染试验、MTT试验和细胞的药物浓度—时间生长曲线分析观察其对MG-63细胞活力的影响;通过流式细胞仪检测MG-63细胞的细胞周期变化。结果:（1）冬凌草甲素能以时间和浓度依赖性方式有效的抑制MG-63细胞增殖,药物抑制MG-63细胞活力的IC50约为13μmol/L。（2）冬凌草甲素能增加MG-63细胞G0/G1期百分率,降低MG-63细胞S期百分率,细胞增殖指数下降。结论:冬凌草甲素能够有效的抑制MG-63细胞的增殖,并呈时间和药物浓度依赖性。第二章冬凌草甲素对MG-63细胞的凋亡诱导效应目的:确定冬凌草甲素是否能诱导MG-63细胞凋亡。方法:用不同浓度的冬凌草甲素作用于MG-63细胞,用Hochest33258染色鉴定MG-63细胞凋亡的形态学特征;用流式细胞仪分析MG-63早期凋亡细胞的百分率;用Caspase-8蛋白印迹分析证明MG-63细胞凋亡发生的分子特征。结果:（1）凋亡细胞形态学鉴定、流式细胞仪检测均有力证明冬凌草甲素能以浓度依赖性方式诱导MG-63细胞凋亡。（2）冬凌草甲素诱导MG-63细胞凋亡伴有Caspase-8蛋白表达上调和裂解激活。结论:冬凌草甲素能以浓度依赖性方式诱导MG-63细胞凋亡。第三章冬凌草甲素对MG-63细胞增殖抑制和凋亡诱导效应的分子机制目的:（1）揭示冬凌草甲素抑制MG-63细胞增殖与细胞周期改变的关系;（2）部分揭示冬凌草甲素对MG-63细胞凋亡诱导的分子机制;（3）确定Caspase-8活化在冬凌草甲素诱导的MG-63细胞凋亡中的重要作用。方法:（1）流式细胞仪检测细胞周期变化;（2）Western印迹检测CyclinD1、P21以及凋亡相关蛋白Survivin、Bcl-2和Bax蛋白表达的变化;（3）TRAP-PCR-ELISA方法检测MG-63细胞端粒酶活性的变化;（4）Z-IETD-fmk阻断试验检测Caspase-8阻断后,冬凌草甲素对MG-63细胞凋亡影响的变化。结果:（1）冬凌草甲素增加G0/G1期MG-63细胞百分率,降低S期MG-63细胞百分率;（2）冬凌草甲素以浓度依赖性方式抑制MG-63细胞的CyclinD1、Survivin和Bcl-2蛋白表达,而P21和Bax蛋白表达上调;（3）冬凌草甲素以浓度依赖性方式抑制MG-63细胞端粒酶的活性;（4）Z-IETD-fmk阻断Caspase-8活性后,能部分逆转和减弱冬凌草甲素对MG-63细胞的凋亡诱导作用。结论:冬凌草甲素通过影响细胞周期调节蛋白、阻断细胞周期G1/S期“稽查点”;抑制Survivin、Bcl-2,上调Bax;抑制端粒酶活性以及活化Caspase-8等途径抑制MG-63细胞增殖及诱导MG-63细胞凋亡。第四章冬凌草甲素对MG-63细胞转移的抑制效应和分子机制目的:确定冬凌草甲素是否具有抑制MG-63细胞转移的能力及其分子机制。方法:用不同浓度的冬凌草甲素作用于MG-63细胞,用体外驱化运动试验检测MG-63细胞运动驱化能力的变化;用RT-PCR检测MG-63细胞中VEGF和MMP-9 mRNA表达的变化;用ELISA方法检测MG-63细胞上清VEGF和MMP-9浓度的变化。结果:（1）体外驱化运动试验证明冬凌草甲素能以浓度依赖性方式抑制MG-63细胞转移。（2）冬凌草甲素以浓度依赖性方式抑制MG-63细胞及其上清中VEGF和MMP-9的表达。结论:冬凌草甲素具有抑制MG-63细胞转移的能力,其机制可能与药物下调VEGF和MMP-9有关。