镁离子转运基因AtMGT7的功能研究

论文摘要

镁离子是植物细胞中最丰富的二价阳离子,其吸收、转运和同化受到严格的调控。迄今为止,镁离子的转运机制在细菌中得到了较详尽阐释。然而,在分子水平上,对植物中镁离子的吸收和转运了解不是很多。2001年,Li等在拟南芥中鉴定了一个可能具镁离子转运功能的AtMGT基因家族。通过序列分析,该家族编码蛋白与细菌CorA及酵母MRS2镁离子转运蛋白有一定同源性。本研究采用RT-PCR方法,克隆到AtMGT家族中的一个基因——AtMGT7基因。该基因具有两种可变剪接转录体,分别命名为AtMGT7a和AtMGT7b。其中,AtMGT7a的开放阅读框含有1158bp,编码386个氨基酸；AtMGT7b的开放阅读框则只含有1113bp,编码371个氨基酸。AtMGT7a和AtMGT7b在拟南芥的表达模式也有差异。AtMGT7a基因在植物的各个组织都表达,而AtMGT7b仅在植物的根与花组织中表达。基因的亚细胞定位研究也显示,AtMGT7a基因主要定位在细胞质膜上,AtMGT7b基因定位在亚细胞器膜上或质膜上。通过功能互补研究,AtMGT7a能互补缺失Mg2+转运活性MM281细菌突变株,AtMGT7b则不能。进一步以同位素63Ni2+为示踪物,对AtMGT7a和AtMGT7b蛋白的离子转运特性进行分析,AtMGT7a为一类低亲和性Mg2+转运蛋白,而AtMGT7b不具Mg2+转运功能,可能与Cu2+或Cd2+转运有关。膜片钳试验结果显示,在外液镁离子浓度为50mM条件,表达AtMGT7a蛋白的HEK293细胞平均膜电流达到286±46pA,是表达AtMGT7b蛋白的HEK293细胞和对照系HEK293细胞平均膜电流的近6倍。表明AtMGT7a蛋白在转HEK293细胞中起着镁离子转运通道作用。对T-DNA插入突变体植株的表型观察,在缺镁离子条件,AtMGT7基因突变体植株叶片颜色比野生型的略浅。进一步测定野生型与突变体植株的叶绿素和镁离子含量,野生型叶绿素和镁离子含量明显高于突变体植株。表明AtMGT7基因编码蛋白与植物中的镁离子吸收和转运有关。综上所述,本研究首次在高等植物中鉴定出一个低亲和性镁离子转运蛋白——AtMGT7a,与已鉴定的AtMGT1等高亲和性镁离子转运蛋白比较,显示了植物中镁离子吸收和转运的多样性。而在转基因HEK293细胞中测得的大量镁离子依赖膜电流,则暗示AtMGT7a蛋白在植物中很可能起着镁离子通道作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩写词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 模式植物拟南芥研究概况
• 1.1.1 拟南芥的生物学特性
• 1.1.2 拟南芥的遗传学特性
• 1.1.3 影响拟南芥生长的主要因素
• 1.2 镁离子化学特性及其在植物中的生理作用研究
• 1.2.1 镁离子概述
• 1.2.2 镁离子的独特化学特性
• 1.2.3 镁离子在植物中的生理作用
• 1.3 镁离子转运蛋白研究
• 1.3.1 原核生物中的CorA镁离子转运蛋白
• 1.3.2 原核生物中MgtA及MgtB镁离子转运蛋白
• 1.3.3 酵母抗铝毒性ALR1和ALR2镁离子转运蛋白
• 1.3.4 酵母线粒体膜上MRS2镁离子转运蛋白
• 2+转运蛋白'>1.3.5 植物中Mg²⁺转运蛋白
• 1.4 本课题研究的背景和意义
• 1.4.1 本课题研究的背景
• 1.4.2 本课题研究的意义
• 第二章 AtMGT7基因的克隆及序列分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料与克隆载体
• 2.2.2 各种酶类及试剂、药品
• 2.2.3 生物信息学分析的主要软件及数据库
• 2.2.4 cDNA克隆
• 2.3 结果
• 2.3.1 AtMGT7基因cDNA克隆
• 2.4 分析
• 第三章 AtMGT7基因功能互补分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验材料与表达载体
• 3.2.2 各种试剂与培养基
• 3.2.3 数据分析软件
• 3.2.4 MM281感受态细胞的制备
• 3.2.5 pTrc99A-AtMGT7表达载体转化MM281细胞
• 3.2.6 菌落的PCR及酶切检测
• 3.2.7 转基因MM281细菌平板培养
• 3.2.8 转基因MM281细菌液体培养
• 2+含量的测定'>3.2.9 细菌中Mg²⁺含量的测定
• 63Ni²⁺同位素示踪实验'>3.2.10⁶³Ni²⁺同位素示踪实验
• 63Ni²⁺示踪实验'>3.2.11⁶³Ni²⁺示踪实验
• 3.2.12 其它二价阳离子的转运对MM821生长的影响
• 3.3 结果
• 3.3.1 pTrc-99A-AtMGT7表达载体的构建
• 3.3.2 AtMGT7a互补细菌缺失镁离子转运蛋白功能,AtMGT7b则不能
• 3.3.3 AtMGT7a是一种低亲和性镁离子转运蛋白
• 2+、Mg²⁺具有高度选择性'>3.3.4 AtMGT7a在二价离子中对Zn²⁺、Mg²⁺具有高度选择性
• 3.3.5 AtMGT7a和AtMGT7b蛋白的表达改变MM281细菌对离子的敏感性
• 3.4 讨论
• 第四章 转AtMGT7基因HEK293细胞的膜片钳分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试验材料与表达载体
• 4.2.2 pEGFP-N3-AtMGT7表达载体构建
• 4.2.3 HEK293细胞的培养
• 4.2.4 细胞转染
• 4.2.5 荧光共定位分析（Co-locolization）
• 4.2.6 表达蛋白质的Western分析
• 4.2.7 膜片钳观察
• 4.3 结果
• 4.3.1 pEGFP-N3-AtMGT7表达载体的构建
• 4.3.2 AtMGT7蛋白在HEK293细胞中的表达
• 4.3.3 AtMGT7a在HEK293细胞中调控镁离子转运
• 4.4 讨论
• 第五章 AtMGT7基因表达模式分析
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试验材料与表达载体
• 5.2.2 各种培养基、酶及试剂
• 5.2.3 AtMGT7基因半定量RT-PCR
• 5.2.4 AtMGT7基因组织表达
• 5.2.5 AtMGT7基因亚细胞定位
• 5.3 结果
• 5.3.1 RT-PCR显示,AtMGT7a和AtMGT7b基因在拟南芥植物的不同组织中转录
• 5.3.2 启动子表达载体构建与转基因植株的获得
• 5.3.3 GUS显色分析,AtMGT7基因启动子在转基因植物的多个组织中具有活性
• 5.3.4 AtMGT7基因在质膜和亚细胞器膜上表达
• 5.4 讨论
• 第六章 AtMGT7基因突变体与过表达植株表形观察
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 试验材料与表达载体
• 6.2.2 AtMGT7基因突变体植株的筛选
• 6.2.3 AtMGT7基因过表达植株的获得
• 6.2.4 表型观察
• 6.3 结果
• 6.3.1 AtMGT7基因突变纯合体植株的获得
• 6.3.2 过表达转基因植株的获得
• 6.3.3 AtMGT7基因突变体植株与过表达植株的RNA转录水平分析
• 6.3.4 突变体植株与过表达植株的表型观察
• 6.3.5 突变体植株、过表达植株与野生型植株的镁离子含量比较
• 6.3.6 突变体植株、过表达植株与野生型植株的叶绿素含量比较
• 6.4 讨论
• 第七章 主要研究结论及进一步研究设想
• 7.1 主要研究结论
• 7.2 进一步研究设想
• 参考文献
• 论文发表与主持科研课题情况
• 致谢