六种虫媒病毒及猪链球菌2型检测蛋白芯片的研制及应用

论文摘要

进入21世纪,传染病仍然是世界范围内引起人类死亡的重要原因,曾一度被控制的传染病又死灰复燃,新传染病不断出现,病原的耐药性增强等都是目前我们面临的严峻挑战。再者,随着世界范围内生物恐怖事件的不断涌现,生物防范已成为各国面临的重要课题。因此,早发现、早诊断对于新（突）发传染性疾病和生物恐怖事件的预防与控制至关重要。近年来,登革病毒（Dengue virus, DENV）、森林脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus, TBEV）、日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）、东方马脑炎病毒（Eastern equine encephalitis virus, EEEV）、西方马脑炎病毒（Western equine encephalitis virus, WEEV）、黄热病毒（Yellow fever virus, YFV）、西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）以及2005年曾在我国暴发流行的猪2型链球菌（Streptococcus suis 2, SS2）等病毒和细菌引发的传染病,由于流行范围广,对社会公共卫生造成很大的威胁。因此,应用新技术、新方法,建立针对重要传染性病原体的高通量、快速筛查及鉴定技术具有重要意义。本课题拟建立针对以上重要传染病病原体的高通量ELISA-array新型检测及鉴别技术,作为对现有检测手段和方法的一个有效的补充和完善,以便在出现新发、突发传染病疫情时,能够从样本中快速鉴定病原体,有效提高我国新发、突发传染病病原体的综合检测分析能力。课题组在前期工作中根据GenBank提供的DENV、TBEV、JBEV、EEEV、WEEV、YFV、WNV以及SS2等病毒及细菌的基因序列,通过BioEdit和Invitrogen等生物分析软件进行多序列比对分析,选择了高度保守的区段来设计引物,并在引物两端加入相应的酶切位点,构建并成功表达了带组氨酸标签的重组蛋白。本课题在此基础上,做了以下工作：1重组蛋白的表达、分离纯化与蛋白芯片的制备本研究采用镍离子亲和层析方法纯化带组氨酸标签的重组蛋白。利用Bio-Dot AD5000TM生物芯片点样仪将蛋白点在聚苯乙烯板材的96孔板上,点制好的芯片用含10%新生牛血清的PBS封闭1h后拍干,室温干燥过夜（或12 h）后,封装保存于4℃。2重组抗原的初步筛选首先使用兔抗血清与芯片上点制的蛋白反应,从16个病毒重组蛋白中筛查出9个特异性良好的病毒抗原,分别为：乙型脑炎病毒抗原JEV-E-D3、登革病毒抗原DEN-E-D3、登革病毒分型抗原DEN1-E-D3、DEN2-E-D3、DEN3-E-D3、DEN4-E-D3、森林脑炎病毒抗原TBE-E-D3、西尼罗病毒抗原WNV-E-D3、东部马脑炎病毒抗原EEE（E1-ecto）。从23个猪2型链球菌重组蛋白中筛查到5个较特异和灵敏的重组抗原,分别为：ssu934、ssu1476、ssu186、ssu1355和MRP。针对筛选出的抗原,用ELISA方法进行验证,并对ELISA-array方法的优势进行了评价,发现ELISA-array检测抗血清中抗体的滴度多为1：6400以上,是常规的ELISA方法的4-16倍。对于筛查到的猪2型链球菌重组抗原,进一步通过猪免疫血清和猪感染血清测试抗原的检测效果,发现抗原ssu253、ssu934、ssu1476、ssu186、ssu1355和MRP与猪免疫前后血清中抗体反应强度的差异具有统计学上的意义（P<0.01）,抗原ssu1000、ssu934、ssu1476、ssu186、ssu1664、ssu1355和MRP与猪感染前后血清中抗体反应强度的差异具有统计学上的意义（P<0.01）。3临床样本验证实验用临床确诊的阳性样本以及健康人样本对筛查出的抗原进行鉴定,同时结合ELISA方法对ELISA-array方法的可信度进行评价。ELISA-array方法检测抗体特异性与灵敏度均优于传统ELISA方法。本研究初步建立了ELISA-array方法针对六种虫媒病毒和猪2型链球菌抗体检测的蛋白芯片技术。以HRP标记的羊抗人IgG和羊抗人IgM为酶标二抗,通过检测蛋白芯片与病人与健康人血清中抗体（IgG和IgM）反应强度的差异,来验证初步筛选出的抗原,同时检测结果也可以用于评价机体处于免疫反应的时期和状态。通过实验,验证了病毒抗原DEN-E-D3、DEN2-E-D3、TBE-E-D3以及猪2型链球菌重组抗原ssu934、ssu186、ssu1664、ssu1355和MRP具有良好的临床检测效果。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 本研究中涉及的人畜共患病的危害及流行近况
• 1.1 登革热
• 1.2 森林脑炎
• 1.3 乙型脑炎
• 1.4 黄热病
• 1.5 西尼罗河热
• 1.6 猪链球菌病
• 2 蛋白芯片技术研究进展
• 2.1 蛋白芯片的概念与分类
• 2.2 蛋白芯片技术的原理
• 2.3 蛋白芯片技术在诊断方面的优势存在问题和应用前景
• 3 ELISA-array蛋白芯片技术
• 3.1 酶联免疫吸附试验
• 3.2 化学发光免疫分析
• 3.3 ELISA-array蛋白芯片技术的原理和优势
• 4 本研究的目的和意义
• 第二章 六种虫媒病毒病原体抗体检测蛋白芯片的研制
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株与质粒
• 1.1.2 酶、试剂盒和主要试剂和血清
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 主要仪器
• 1.1.5 引物的设计与合成
• 1.2 方法
• 1.2.1 重组表达质粒的构建
• 1.2.2 重组菌的诱导表达及鉴定
• 1.2.3 重组蛋白的纯化
• 1.2.3.1 可溶性表达形式目的蛋白的纯化
• 1.2.3.2 包涵体表达形式目的蛋白的纯化
• 1.2.4 蛋白的透析及定量
• 1.2.5 蛋白芯片的制备
• 1.2.5.1 点制蛋白芯片
• 1.2.5.2 蛋白芯片的质控及操作过程
• 1.2.6 病毒抗原的初步筛选
• 1.2.7 针对初筛病毒抗原的ELISA方法验证与对比试验
• 1.2.8 临床血清样本验证已筛选出的病毒抗原及ELISA-array方法可信度评价
• 2 结果与分析
• 2.1 重组菌的表达及鉴定结果分析
• 2.2 蛋白纯化结果
• 2.3 重组抗原的筛选
• 2.3.1 兔抗血清初步筛选病毒抗原结果
• 2.3.2 蛋白芯片初步筛选病毒抗原结果分析
• 2.3.2.1 特异性分析
• 2.3.2.2 回归方程线性相关性分析
• 2.3.3 ELISA对比试验
• 2.3.3.1 特异性对比分析
• 2.3.3.2 灵敏度对比分析
• 2.4 临床血清样本评价ELISA-array方法可信度
• 2.4.1 蛋白芯片的质控
• 2.4.2 临床阳性样本的芯片检测结果
• 2.4.3 临床阳性样本抗体水平的ELISA对比实验结果
• 3 讨论
• 3.1 重组抗原的纯化
• 3.2 重组抗原的特异性
• 3.3 利用以上几种病毒重组抗原研究建立诊断方法的优势
• 第三章 猪链球菌2型病原体抗体检测蛋白芯片的研制
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 试剂和血清
• 1.1.3 THY培养基以及ELISA用溶液的配制
• 1.1.3.1 THY培养基
• 1.1.3.2 ELISA用溶液
• 1.1.4 主要仪器
• 1.1.5 引物的设计与合成
• 1.2 方法
• 1.2.1 重组抗原的表达
• 1.2.2 重组抗原的纯化
• 1.2.3 ELISA-array蛋白芯片初步筛选重组抗原
• 1.2.4 猪免疫血清筛选重组抗原实验
• 1.2.5 猪感染血清筛选重组抗原实验
• 1.2.6 临床阳性血清样本验证实验
• 2 结果与分析
• 2.1 重组蛋白的表达形式鉴定
• 2.2 重组蛋白的纯化
• 2.3 兔抗血清初筛抗原结果
• 2.4 猪免疫血清蛋白芯片反应结果
• 2.5 猪感染血清芯片反应结果
• 2.6 临床样本验证实验结果
• 3 讨论
• 3.1 蛋白检测芯片对抗原纯度的要求
• 3.2 抗原模拟样本筛选与临床样本检测结果对比分析
• 3.3 临床阳性血清样本抗体检测结果分析
• 第四章 全文总结
• 1 ELISA-array蛋白芯片技术初步筛选出9个病毒和5个猪链球菌2型特异和敏感的抗原
• 2 采用传统ELISA方法对备选抗原的特异性和灵敏度进行了证实
• 3 用于检测六种虫媒病毒抗体的ELISA-array蛋白芯片具有良好的检测灵敏度和特异性
• 4 用于检测猪链球菌2型抗体的ELISA-array蛋白芯片具有良好的检测灵敏度和特异性
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 常用缓冲液及溶液的配置
• 附录Ⅱ 在读硕士期间发表文章