慢性心房颤动患者心房肌KChIP2基因mRNA水平的定量检测和表达质粒pEGFP-KChIP2的构建

论文摘要

目的:心房颤动（Atrial Fibrillation,AF）简称房颤,是最为常见的快速性心律失常之一,其患病率随着年龄的增长而增加,容易引起心房内血栓、脑栓塞等严重并发症,有很高的死亡率[1-3]。业已证明,房颤时,心肌细胞钾通道、钙通道等发生明显改变,其电流水平和相应的编码基因和蛋白水平存在明显的上调或下调[4-8]。人心肌细胞瞬时外向钾电流（Ito）主要由Kv4.3（KCND3）基因编码,是心肌复极化的重要离子流,决定动作电位的早期复极并且影响其它复极化离子流[9]。KChIP2（Kv channel interacting protein 2, KChIP2）是心肌细胞瞬时外向钾通道的重要调控亚单位,参与调控通道基因表达和电流特性,在Ito发挥正常功能中起着不可或缺的作用[10, 11]。本课题采用实时荧光定量PCR技术通过对房颤时KChIP2和KCND3基因mRNA水平进行定量研究,探讨KChIP2在房颤中的作用和对于瞬时外向钾通道的可能调控机制。方法:①30例接受体外循环手术的风湿性心脏病（rheumatic heart disease,RHD）患者分为两组:窦性心律组（SR组）13例、房颤心律组（AF组）17例,取其常规切除的右心耳组织作为研究对象;②提取心房肌组织总RNA,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和TA克隆技术构建含有目的基因片段的质粒标准品和标准曲线;③以GAPDH为内参照基因,采用SYBR Green I法实时荧光定量PCR技术检测慢性心房颤动和窦性心律患者KChIP2和KCND3基因mRNA水平;结果:①总RNA质量:提取的总RNA通过紫外分光光度仪测量,A260/A280在1.80-2.10之间,A260/A230在1.90-2.20之间,浓度大于300ng/μl,通过1%琼脂糖凝胶电泳得出,28S带和18S带明显,灰度比大于1,5S带不明显,无拖尾;②标准曲线和熔解曲线:标准曲线线性关系良好,相关系数R2>0.99,KChIP2基因的标准曲线为y=-0.23x+6.69（R2=0.994）,KCND3基因的标准曲线为y=-0.20x+6.24（R2=0.996）,GAPDH基因的标准曲线为y=-0.23x+5.94（R2=0.998）,熔解曲线呈明显单峰状,退火温度与预测值基本一致;③SR组和AF组KChIP2/GAPDH比值分别为0.2200±0.0388（n=13）,0.1468±0.0452（n=17）,AF组KChIP2基因mRNA水平低于SR组,P<0.01;SR组和AF组KCND3/GAPDH比值分别为0.5257±0.1427（n=13）,0.3946±0.1826（n=17）,AF组KCND3基因mRNA水平低于SR组,P<0.05;结论:与窦性心律患者相比,心房颤动患者KChIP2基因和KCND3基因明显下调,KChIP2和KCND3基因下调是房颤时Ito电流下调的分子基础。目的:瞬时外向钾电流（Ito）是人心肌复极化的主要离子流,决定动作电位的早期复极并影响其它复极化离子流。大量研究表明,瞬时外向钾电流在心房颤动[4,5,30]、心力衰竭和心肌肥大[15]等疾病中电流密度下调,其编码的基因和蛋白质水平都呈相应的下调。KChIPs作为瞬时外向钾通道最重要的辅助亚基,在调控通道基因表达和电流特性中起重要作用。KChIP2能够促进瞬时外向钾通道蛋白由内质网向细胞膜的运输和增加通道在细胞膜的表达,能够较大的增加Ito电流密度,减慢Ito失活,加快失活后恢复和增加Kv4通道mRNA水平,表明KChIP2在维持Ito的电生理学特性中扮演重要角色[10,11,23,24,31-33]。本实验拟采用RT-PCR和定向克隆技术,构建人心房肌KChIP2基因表达质粒pEGFP-KChIP2,为进一步研究KChIP2对瞬时外向钾通道的调控功能奠定基础。方法:①取接受体外循环手术常规切除的右心耳作为研究对象,提取总RNA,逆转录得到cDNA;②通过特异性引物进行PCR扩增得到KChIP2编码区全长序列,亚克隆到pMD18-T载体中,得到重组克隆质粒pMD18-T-KChIP2;③再设计带有酶切位点Hind III和BamH I的特异性引物,对重组克隆质粒pMD18-T-KChIP2进行PCR扩增,得到含有酶切位点的KChIP2编码区全长序列;④对含有酶切位点的KChIP2全长片段和pEGFP-c1进行Hind III和BamH I双酶切反应,然后进行电泳后胶回收,再进行连接反应;⑤连接之后转入感受态大肠杆菌中,过夜培养;⑥提取质粒,测序鉴定。结果:①KChIP2编码区全长扩增片段电泳结果与目的大小663bp位置一致;②质粒测序结果与PubMed数据库KChIP2（AY026328）序列比对,其中661bp完全匹配,其中第253位碱基由T→C,相应的氨基酸由苯丙氨酸（TTC）→亮氨酸（CTC）,第344位碱基由T→C,相应的氨基酸由苯丙氨酸（TTT）→丝氨酸（TCC）,同源性为99%。结论:成功构建人心房肌KChIP2基因表达质粒,为下一步转染实验研究KChIP2对瞬时外向钾通道的功能调控奠定了基础。

论文目录

• 一、慢性心房颤动患者心房肌KChIP2 基因mRNA 水平的定量检测和表达质粒pEGFP-KChIP2 的构建
• 1 第一部分慢性心房颤动患者心房肌KChIP2 基因mRNA 水平的定量检测
• 1.1 中文摘要
• 1.2 英文摘要
• 1.3 前言
• 1.4 材料与方法
• 1.5 结果
• 1.6 讨论
• 1.7 结论
• 2 第二部分人心房肌细胞KChIP2 基因表达质粒pEGFP-KChIP2 构建
• 2.1 中文摘要
• 2.2 英文摘要
• 2.3 前言
• 2.4 材料与方法
• 2.5 结果
• 2.6 讨论
• 2.7 结论
• 3 参考文献
• 4 英汉缩略词对照表
• 二、致谢
• 三、心肌组织瞬时外向钾通道的研究进展（综述）
• 四、在读期间发表的论文