铅镉对小鼠卵泡颗粒细胞凋亡及凋亡基因表达的影响

论文摘要

镉（Cd）、铅（Pb）是常见的环境污染物。它们除了具有神经、造血、消化、肾脏、肝脏及心血管等系统毒性外,还具有生殖毒性。本实验主要通过研究这两种重金属对颗粒细胞凋亡的影响来探讨其对小鼠生殖机能的毒性作用；而细胞凋亡的发生又与凋亡相关基因的基因组群有关,这些基因根据功能可分为凋亡基因和凋亡抑制基因,前者诱导细胞凋亡,主要有Bax、Bad、Bim、Bik、p53、Bcl-Xs等；后者抑制细胞凋亡,主要有Bcl-2、Bcl-X、Mcl-1等,其中Bcl-2和Bax是细胞凋亡过程中起关键性作用的一对功能基因。本实验主要讨论凋亡发生过程中这两个基因的相对表达量,从分子水平反应重金属对凋亡的影响。本研究以25日龄小鼠为研究对象,分别用0.5m/kg、1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg醋酸铅溶液连续攻毒5d,氯化镉溶液攻毒48h,对照组小鼠注射超纯水。醋酸铅溶液攻毒5d、氯化镉溶液攻毒48h后,各组小鼠注射PMSG,48h后脱颈椎法处死小鼠,取出卵巢,用5号针头刺破卵泡,收集颗粒细胞,用流式细胞仪检测颗粒细胞凋亡率。结果显示：连续攻毒醋酸铅一周的小鼠,2mg/kg组颗粒细胞凋亡率最高。对照组、0.5mg/kg组与其有极显著差异（P<0.01）,1mg/kg组、4mg/kg组与其有显著差异（P<0.05）,其余各组均无显著性差异（P>0.05）。而一次性攻毒氯化镉48h的小鼠,各组之间均无差异显著性。根据NCBI上已发表的小鼠Bcl-2和Bax mRNA序列,在跨外显子序列处设计引物。采集小鼠卵巢组织,利用Trizol法提取总RNA,然后用RT-PCR法进行cDNA扩增,通过半定量RT-PCR检测Bcl-2和Bax在小鼠卵巢中的表达情况。结果发现,在2mg/kg浓度范围内,随着攻毒剂量的增加,Bcl-2表达量依次减弱,且极显著低于对照组（P<0.01）,Bcl-2/Bax比值在该浓度范围内也逐渐下降,但当醋酸铅浓度升高,为4mg/kg时,Bcl-2及Bcl-2/Bax值则有所升高,但均低于对照组；0.5mg/kg组小鼠Bax表达量最高,且极显著高于对照组和其它实验组（P<0.01）,2mg/kg组则显著低于对照组和1mg/kg组（P<0.05）,其余各组间均无显著性差异。相对于Bcl-2的表达水平,Bax的表达普遍较强。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第1章 文献综述
• 1. 引言
• 2. 铅的概述
• 2.1 铅对雌性动物生殖机能的影响
• 2.1.1 铅对卵巢的影响
• 2.1.2 铅对卵母细胞的影响
• 2.2 铅对雄性动物生殖机能的影响
• 2.2.1 铅对睾丸的影响
• 2.2.2 铅对精子生成和发育的影响
• 2.3 铅中毒机制
• 2.3.1 铅抑制抗氧化酶系统
• 2.3.2 铅对关键酶的影响
• 3. 镉的概述
• 3.1 镉对雌性动物生殖机能的影响
• 3.1.1 镉对卵母细胞的影响
• 3.1.2 镉对颗粒细胞的影响
• 3.2 镉对雄性动物生殖机能的影响
• 3.2.1 镉对睾丸的影响
• 3.2.2 镉对精子的影响
• 3.2.3 镉中毒机理
• 4 颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁
• 4.1 颗粒细胞对卵母细胞的作用
• 4.2 颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁
• 5 细胞凋亡及其相关基因
• 5.1 细胞凋亡概述
• 5.2 细胞凋亡的检测方法
• 5.3 凋亡相关基因
• 5.3.1 Bcl-2基因家族
• 5.3.2 P53基因
• 5.3.3 Caspase基因家族
• 5.3.4 Fas基因
• 5.3.5 C-myc基因
• 6 本研究的目的和意义
• 参考文献
• 第2章 铅镉对小鼠卵泡颗粒细胞凋亡的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 动物分组及攻毒
• 1.4.2 颗粒细胞的提取
• 1.4.3 颗粒细胞凋亡的检测
• 1.4.4 统计学处理
• 2. 结果与分析
• 2.1 铅、镉对小鼠体重的影响
• 2.2 铅、镉对小鼠颗粒细胞凋亡的影响
• 3. 讨论与小结
• 3.1 讨论
• 3.2 小结
• 参考文献
• 第3章 铅对小鼠卵巢组织中Bcl-2和Bax基因表达的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 网络资源及软件
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.1.5 主要溶剂的配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 实验动物的处理
• 1.2.2 实验器皿的处理
• 1.2.3 总RNA的提取
• 1.2.4 总RNA的DNAse处理
• 1.2.5 引物设计
• 1.2.6 cDNA合成
• 1.2.7 PCR扩增目的基因
• 2. 结果与分析
• 2.1 RNA浓度的电泳检测
• 2.2 Bcl-2、Bax及β-actin扩增指数期循环数的确定
• 2.3 Bax、Bcl-2及β-actin扩增指数期循环数摸索结果
• 2.4 Bax基因RT-PCR产物检测
• 2.5 Bcl-2基因RT-PCR产物检测
• 2.6 β-actin基因RT-PCR产物检测
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文