n-3PUFA抑制NFκB活化与骨骼肌生长的关系研究

论文摘要

本试验的目的是研究日粮中持续添加亚麻籽（富含n-3 PUFA）对生长肥育期猪肌肉生长的影响,并在细胞水平探讨了n-3 PUFA影响肌肉生长的分子机制。课题的研究内容由两部分组成,第一部分为动物试验,研究日粮中持续添加亚麻籽（富含n-3 PUFA）对生长肥育期猪肌肉块重量的影响,并在机体水平研究了基因表达与肌肉块重之间的关系;第二部分为细胞培养试验,是针对日粮中持续添加亚麻籽（富含n-3 PUFA）对生长肥育期猪肌肉生长的调控效果,在细胞水平探讨了n-3 PUFA调控肌肉生长的分子机制。第一部分,动物试验。试验采用单因子完全随机设计,选择80±4d健康去势公猪24头,按体重随机分为4组,每组6重复栏,单栏饲养。设计生长期（80-140d）及肥育期（140-170d）两种日粮,其中对照日粮由玉米、豆粕和脂肪粉等主要原料构成;试验日粮中加入10%的亚麻籽而不用脂肪粉,两种日粮等能等氮。4组猪随机接受日粮处理,其中第1组饲喂对照日粮（C组）,其余3组猪分别在屠宰前30d,60d和90d饲喂试验日粮（分别为T1,T2和T3组）,而其他时间饲喂对照日粮,试验期共90d。度量了各处理组胴体性状和肉质性状;以及背最长肌、后肢肌肉块重量（股四头肌、股二头肌、瓣膜肌、半腱肌、股薄肌和腰肌）的影响;采用气相色谱方法分析了饲料、肌肉以及脂肪组织中脂肪酸组成。并利用半定量RT-PCR法测定超氧化物酶体增殖激活受体（peroxisomeproliferators-activated receptor,PPARγ）及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor,TNFα）在脾脏、肌肉组织和脂肪组织中的mRNA丰度,在试验结束时用ELISA试剂盒测定血清中TNFα浓度。主要研究结果如下:1.猪生长肥育期添加亚麻籽对组织中n-3PUFA富集量和肌肉块重量的影响。在生长肥育猪170日龄屠宰时,尽管各处理组背膘厚、瘦肉率、眼肌面积均没有显著影响（P＞0.05）。各处理组股二头肌重、瓣膜肌、半腱肌和腰肌重差异不显著（P＞0.05）。背最长肌、股四头肌和股薄肌重随亚麻籽添加时间的延长呈线性上升（P＜0.05）。背最长肌,皮下脂肪组织中LNA含量随亚麻籽添加时间的延长呈极显著线性上升（P＜0.01）。背最长肌和皮下脂肪组织中二十碳五烯酸（eicosapentenoic acid,EPA）和二十二碳五烯酸（Docosapentaenoic Acid,DPA）含量随添加时间的延长呈极显著线性上升（P＜0.01）。此外,肌肉组织中二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid,DHA）含量随添加时间的延长呈极显著二次曲线上升（P＜0.01）。回归分析发现背最长肌重随肌肉中n-3PUFA（R2=0.89,P＜0.01）,尤其是α-亚麻酸（α-Linolenic acid,LNA）（R2=0.86,P＜0.01）含量的增加而呈显著的二次曲线上升。这些结果表明在生长肥育猪屠宰前30d-90d添加亚麻籽,通过提高组织中n-3PUFA富集量,促进了背最长肌、半腱肌和股薄肌的生长,提高肌肉重。2.为进一步在机体水平研究基因表达与肌肉块重之间的关系,试验分析了猪生长肥育期添加亚麻籽对PPARγ、TNFα基因表达和肌肉块重量的影响。脾脏中PPARγ的表达随亚麻籽添加时间增加呈线性增加（P＜0.01）,肌肉组织中则呈二次曲线增加（P＜0.01）,但脂肪组织中PPARγ的表达量没有受到亚麻籽添加的影响（P=0.095）。随着亚麻籽添加时间的延长,脾脏中的TNFαmRNA丰度呈线性降低（P＜0.01）,肌肉组织中（P＜0.01）和脂肪组织（P＜0.01）中TNFα的mRNA丰度也随亚麻籽添加时间呈线性降低。随着亚麻籽添加时间的延长,血清中TNFα浓度线性降低（P＜0.01）。脾脏中PPARγ与TNFα（R2=0.77,P＜0.001）的mRNA丰度有极显著的负相关。肌肉组织中PPARγ的表达量与TNFα（R2=0.70,P=0.002）有极显著的负相关。脾脏中PPARγ的表达量与血清中TNFα浓度有极显著的负相关（R2=0.59,P＜0.01）。肌肉组织中PPARγ的表达量与血清中TNFα浓度之间显著的负相关（R2=0.52,P＜0.05）。回归分析发现背最长肌重分别与背最长肌中PPARγ表达量（R2=0.80,P＜0.01）和TNFα表达量（R2=0.87,P＜0.01）有显著的二次曲线关系。结果表明持续添加亚麻籽日粮可能以依赖PPARγ的机制下调TNFα基因表达,从而提高生长肥育猪肌肉块重量。第二部分,细胞培养试验。为了进一步研究持续添加亚麻籽日粮对生长肥育猪骨骼肌重的影响机制,体外培养C2C12小鼠骨骼肌细胞。试验分为4组,其中第1组为在培养的小鼠C2C12骨骼肌细胞中添加牛血清蛋白（Bovine serumalbumin,BSA）（正对照组）,第2组为添加棕榈酸（Palmitic acid,PTA）（负对照组）,第3组为添加α-亚麻酸（α-linolenic acid,LNA）,第4组为添加二十碳五烯酸（eicosapentenoic acid,EPA）。在培养的小鼠C2C12骨骼肌细胞中分别添加600μM BSA、PTA、LNA和EPA,培养24小时后,细胞用100nM胰岛素培养10min,采用实时定量PCR方法测定各处理组PPARγ、TNFα及肌肉环状指基因1（muscle RING finger 1,MuRF1）基因的表达量。同时,培养的小鼠C2C12骨骼肌细胞中分别添加300μM、600μM的BSA、PTA、LNA和EPA,培养24小时后,细胞用100nM胰岛素培养10min,采用Western blot方法测定了各处理组骨骼肌细胞中IκBα蛋白量。试验进一步在培养的小鼠C2C12骨骼肌细胞中分别添加300μM、600μM的BSA、PTA、LNA和EPA,培养24小时后,细胞用100nM胰岛素培养10min,采用EMSA方法测定了各处理组骨骼肌细胞中NF-κB活性的影响。主要研究结果如下:n-3PUFA对C2C12骨骼肌细胞NF-κB活性和MuRF1基因的影响。在培养的骨骼肌细胞中持续添加的EPA（600μM,24小时）能够提高PPARγmRNA的丰度2.3倍数（P＜0.01）。LNA只提高了PPARγmRNA的丰度1.08倍。而600μM棕榈酸,培养24小时,抑制了PPARγ基因的mRNA丰度（P＜0.01）。分别在小鼠C2C12骨骼肌细胞中分别添加600μM LNA、EPA,培养24小时,TNFα基因的mRNA丰度分别被抑制了1.06、2.93倍。而棕榈酸通过抑制了PPARγ基因的mRNA丰度,提高了TNFα基因表达（P＜0.01）。小鼠C2C12骨骼肌细胞中分别添加300μM LNA、EPA,培养24小时,并没有影响到骨骼肌中IκBα的蛋白质表达量。在同样条件下,分别添加600μM LNA和EPA,LNA依然没有影响到骨骼肌中IκBα的蛋白质表达量,而IκBα的蛋白质表达量被EPA显著提高了86%（P＜0.01）。添加棕榈酸（600μM,24小时）能够降低细胞中39%IκBα蛋白质水平。分别添加600μM LNA和EPA,LNA没有影响到C2C12细胞核中NF-κB的蛋白质含量,而EPA降低了细胞核中NF-κB的蛋白质含量;添加600μM PTA提高了C2C12细胞核中NF-κB的蛋白质含量。在本试验中,分别添加600μM LNA和EPA,LNA并没有影响到骨骼肌细胞中MuRF1基因表达,而MuRF1基因表达量被EPA显著抑制了3.38倍（P＜0.01）。添加促进IκBα蛋白质降解的棕榈酸（600μM,24小时）极显著提高了MuRF1基因表达（P＜0.01）。结果表明,二十碳五烯酸通过PPARγ/TNFα/IκBα/NF-κB信号通路,抑制了MuRF1基因表达,从而减少了骨骼肌蛋白质降解,促进正常生产条件下动物骨骼肌生长。结论:1、在生长肥育猪屠宰前30d-90d添加亚麻籽,通过提高组织中n-3PUFA富集量,促进了背最长肌、半腱肌和股薄肌的生长,提高肌肉重。2、持续添加亚麻籽日粮可能以依赖PPARγ的机制下调TNFα基因表达,从而提高生长肥育猪肌肉块重量。3、二十碳五烯酸通过PPARγ/TNFα/IκBα/NF-κB信号通路,抑制了MuRF1基因表达,从而减少了骨骼肌蛋白质降解,促进正常生产条件下动物骨骼肌生长。

论文目录

摘要

ABSTRACT

缩略语

第一章文献综述

1 前言

2 促炎细胞因子的主要分类及细胞来源

2.1 肿瘤坏死因子

2.2 白细胞介素1

2.3 白细胞介素6

3 促炎细胞因子对动物骨骼肌生长的影响

4 促炎细胞因子影响骨骼肌蛋白质分解途径的机制

4.1 骨骼肌蛋白质的分解代谢

4.2 MuRF-1和MAFbx基因在骨骼肌蛋白的分解代谢中的作用

4.3 NF-κB对MuRF1的调控作用

4.4 促炎细胞因子与NF-κB的活化

5 n-3 PUFA对炎症和免疫功能影响的分子机制

5.1 n-3PUFA对细胞内脂肪酸代谢产物的影响

5.2 n-3PUFA对细胞膜磷脂脂肪酸构成的影响

5.3 n-3PUFA对酶作用的影响

5.4 n-3PUFA对细胞膜流动性的作用

5.5 n-3PUFA对促炎细胞因子产生的影响

5.6 n-3PUFA对促炎细胞因子基因表达的影响

5.6.1 过氧化物酶体增殖物激活受体

5.6.2 核因子κB

5.6.3 PPARs/NF-κB信号通路对促炎细胞因子的调控作用

6 亚麻籽日粮对猪组织中n-3PUFA富集量的影响

7 n-3PUFA通过抑制NF-κB的活化影响骨骼肌生长的可能机制

研究目的与意义

第二章猪生长肥育期添加亚麻籽对组织中n-3PUFA富集量和肌肉重的影响

1 前言

2 材料与方法

2.1 试验设计与试验日粮

2.2 试验动物

2.3 饲养管理

2.4 测定指标及方法

2.4.1 胴体和肉质

2.4.2 脂肪酸组成的分析

2.5 数据处理

3 试验结果

3.1 日粮脂肪酸组成

3.2 添加亚麻籽日粮对生长肥育猪胴体性状、肉质品质的影响

3.3 添加亚麻籽日粮对生长肥育猪肌肉块重量的影响

3.4 添加亚麻籽日粮对生长肥育猪脂肪酸组成的影响

3.4.1 猪背最长肌脂肪酸组成

3.4.2 猪皮下脂肪脂肪酸组成

3.5 背最长肌中脂肪酸组成与背最长肌重的关系

4 讨论

4.1 亚麻籽来源的n-3 PUFA对生长肥育猪脂肪酸组成的影响

4.2 添加亚麻籽日粮对生长肥育猪肉质品质的影响

4.3 亚麻籽来源的n-3 PUFA对生长肥育猪肌肉重的影响

第三章猪生长肥育期添加亚麻籽对PPARγ、TNFα基因表达和肌肉块重量的影响

1 前言

2 材料与方法

2.1 试验设计与试验日粮

2.2 试验动物

2.3 饲养管理

2.4 组织样及血样采集

2.5 仪器设备和试剂

2.5.1 主要仪器设备

2.5.2 试剂来源

2.5.3 试剂配制

2.6 测定指标及方法

2.6.1 胴体性状

2.6.2 促炎细胞因子基因表达

2.7 数据处理

3 结果和分析

3.1 添加亚麻籽日粮对生长肥育猪肌肉块重量的影响

3.2 基因表达

3.2.1 日粮中添加亚麻籽对PPARγ表达量的影响

3.2.2 日粮中添加亚麻籽对TNFα表达量的影响

3.3 日粮中添加亚麻籽对血清中TNFα浓度的影响

3.4 PPARγ和促炎细胞因子表达量的相关分析

3.5 PPARγ表达量与血清中促炎细胞因子浓度的相关分析

3.6 基因表达和背最长肌肉重的关系

4 讨论

第四章 n-3PUFA对C2C12骨骼肌细胞NF-κB活性和MuRF1基因的影响

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 试剂

2.3 主要仪器、设备及器皿

2.4 溶液

2.4.1 细胞培养用液的配制

2.4.2 琼脂糖凝胶电泳缓冲液

2.4.3 抗生素贮存液

2.4.4 十二烷基硫酸钠-丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）缓冲液

2.4.5 Western blott缓冲液

2.4.6 其它缓冲液

2.5 试验用品的清洗与消毒

2.5.1 玻璃器皿的清洗和消毒

2.5.2 金属器械的清洗和消毒

2.5.3 橡胶和塑料用品的清洗和消毒

2.6 细胞的冻存和复苏

2.6.1 细胞的冻存

2.6.2.细胞的复苏

2.7 细胞培养（小鼠C2C12成肌细胞系）

2.8 Western blot测定IκBα蛋白表达量

2.8.1 单层贴壁细胞总蛋白的提取

2.8.2 蛋白质的SDS-PAGE检测

2.8.3 电转

2.8.4 染色

2.8.5 封闭

2.8.6 第一抗体和靶蛋白结合

2.8.7 酶标二抗与硝酸纤维素滤膜的温育

2.8.9 加入底物显色

2.9 基因表达

2.9.1 总RNA的提取

2.9.2 总RNA质量检测

2.9.3 总RNA的DNase-Ⅰ处理

2.9.4 总RNA反转录,合成cDNA第一链

2.9.5 PPARγ、TNF-α,MuRF1及β-actin基因的定量PCR

2.10 凝胶阻滞电泳

2.10.1 核蛋白的提取

2.10.2 探针的标记与纯化

2.10.3 探针的纯化

2.10.4 测定探针的放射活性

2.10.5 凝胶迁移阻滞法测定NF-κB

2.11 数据处理

3 结果和分析

3.1 不同脂肪酸对PPARγ、TNFα和MuRF1基因表达量的影响

3.2 不同浓度脂肪酸对IκBα蛋白质表达量的影响

3.3 不同脂肪酸对NF-κB活性的影响

4 讨论

第五章结语

1 结论

1.1 持续添加亚麻籽日粮对生长肥育猪组织中n-3 PUFA富集量和肌肉块重量的影响

1.2 持续添加亚麻籽日粮对生长肥育猪组织中PPARγ、TNFα基因表达和肌肉块重量的影响

1.3 n-3PUFA对C2C12骨骼肌细胞IκBα蛋白和MuRF1基因的影响

2 创新点

参考文献

附录在读期间发表的主要研究论文

致谢

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