论文摘要
研究背景：缺血性脑卒中（iSchemic stroke,IS）为脑卒中最常见的类型,其原因包括动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）斑块致血管狭窄或闭塞,血栓形成、腔隙梗死和脑栓塞等。高血压、动脉粥样硬化以及血小板增多均与缺血性脑卒中的发生发展密切相关。环氧-二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids,EETs）是花生四烯酸经细胞色素P450氧化酶代谢产生的内源性生物活性物质,具有抗炎、舒张血管和抗血小板等作用,可抑制高血压和AS的发生发展,而EETs灭活代谢酶可溶性环氧化物水解酶（sEH）编码基因（EPHX2）的遗传多态性可通过影响体内EETs的水平,影响AS相关疾病的易感性。MicroRNA 146a（miR-146a）是一种与炎症密切相关的微小RNA（microRNA）,多种参与AS发生发展的免疫和炎症相关因子如LPS、IL-1和TNF-a等都可促进rniR-146a的表达。miR-146a前体内存在影响其成熟的单核苷酸多态性rs2910164（C/G）。生物信息学分析表明,EPHX2 3’端非翻译区（3’-UTR）存在呈完全连锁不平衡的潜在miRNA结合位点多态rs1042032 A/G（miR-183结合位点）和rs1042064 T/C（miR-576-3p结合位点）,以及潜在的miR-146a结合位点。我们推测,EPHX2 rs1042032 A/G和rs1042064 T/C位点可能具有功能,EPHX2与miR-146a基因的遗传多态性之间可能存在相互作用,共同影响IS的发病风险。目的：通过病例-对照研究,明确EPHX2 rs1042032 A/G和miR-146a rs2910164（C/G）多态性单独及联合作用对长沙地区汉族人群IS遗传易感性的影响,探讨其可能的分子机制。方法：收集IS患者及健康对照人群血液标本并提取外周血DNA,聚合酶链反应一限制性片段长度多态性对所有病例和正常对照组人群EPHX2 rs 1042032（A/G）和miR-146a rs2910164（G/C）多态性进行基因分型；实时定量PCR测定缺血性脑卒中患者外周血单个核细胞（PBMC）中：miR-146α以及EPHX2 mRNA表达；报告基因实验分析EPHX2是否为miR-146a的靶基因；miR-146a模拟物处理培养的脐静脉内皮细胞（HUVEC）,实时定量PCR测定细胞内miR-146a和EPHX2 mRNA表达；X2检验比较病例和对照人群rs2910164和EPHX2rs1042032基因型分布的异同,非条件Logistic回归分析确定EPHX2rs1042032和miR-146ars2910164多态性单独及联合与IS易感性的关联关系。结果：健康对照人群中EPHX2 rs1042032多态性位点AA、AG和GG基因型的频率分别为35.7%、52.0%和12.3%,IS患者中rs1042032多态性位点AA、AG和GG基因型的频率分别为39.6%、46.2%和14.2%,IS病例组与对照组rs1042032多态基因型分布无显著差异（P>0.05）。与对照组相比较,腔隙梗死所致IS患者中rs1042032AA基因型频率显著升高（P=0.046）,动脉粥样硬化性（AS）梗死所致IS患者中rs1042032 AA基因型频率有升高的趋势（P=0.058）,动脉血管性疾病所致IS（腔梗+动脉粥样硬化性梗死）患者中rs1042032AA基因型频率显著升高（P=0.017）,而其他原因所致IS患者中rs1042032 AA基因型频率显著下降（P=0.018）。经非条件Logistic回归分析对脑卒中的风险因素进行校正,发现携带rs1042032 AA基因型的个体较携带rs1042032 G等位的个体患腔隙梗死所致IS的发病风险有增加的趋势（OR=1.428,95% CI：1.000～2.089,P=0.051）；而血管病变所致IS的发病风险显著增加（OR=1.37,95%CI：1.039～1.793,P=0.023）。在合并高脂血症的人群中,IS患者中rs1042032 AA基因型频率显著高于对照人群（分别为44.9%和32.0%,P=0.006）,但血脂正常的IS病例和对照人群中rs1042032多态位点基因型分布无差异。对照人群中miR-146a rs2910164多态位点CC、CG和GG基因型的频率分别为35.1%、46.8%和18.2%,IS患者中rs2910164多态位点CC、CG和GG基因型的频率分别为32.6%、48.5%和18.9%；病例组与对照组间rs2910164多态位点基因型分布无显著差异；与对照组相比较,AS所致IS患者中rs2910164 CC基因型频率（40.1%）有升高的趋势,但无显著的统计学差异（P=0.091）。非条件Logistic回归分析结果提示,rs2910164 CC基因型增加AS所致IS的发病风险OR值为1.382（95%CI：0.957～1.995,P=0.084）。血脂正常的IS患者中rs2910164 CC基因型频率（43.3%）显著高于对照人群（34.6%,P=0.038）,而血脂异常的IS病例和正常对照组间rs2910164位点基因型分布无显著差异。两个基因SNP位点联合基因型分析结果表明,与不携带EPHX2 rs1042032和miR-146a rs2910164风险基因型的个体相比较,基因型为rs1042032 AA/rs2910164 CC的个体患AS所致IS的发病风险显著增加（OR= 1.462,95%CI:1.113～1.921,P=0.006）,而只携带两个SNP位点任意一种风险基因型的个体患AS所致IS的发病风险无显著变化（OR=1.034,95%CI：0.697～1.534,P=0.869）。41例IS患者外周血单个核细胞（PBMC）中miR-146a与EPHX2 mRNA表达水平间呈显著的负相关（Pearson’sr=-0.363,P=0.020）；与携带rs1042032 G等位的个体相比较,基因型为EPHX2 rs1042032 AA的IS患者PBMC中EPHX2 mRNA表达有降低的趋势,但差异未达显著性（P>0.05）；与miR-146a rs2910164CC基因型IS患者相比较,rs2910164 GC和rs2910164 GG基因型患者PBMC中IniR-146a表达均显著降低（P值分别为0.039和0.006）；携带rs1042032 AA/rs2910164 CC联合基因型的IS患者PBMC中IEPHX2mRNA表达水平显著低于其他基因型组（P<0.05）,而miR-146a表达水平显著高于其他基因型组（P<0.01）。与携带EPHX2 3’-UTR区rs 1042032 G-rs 1042064 C单倍型的质粒相比,携带rs1042032 A/rs1042064 T单倍型的质粒报告基因活性显著降低（P=0.022）,miR-146a可显著降低携带rs 1042032 G/rs 1042064 C单倍型质粒报告基因的活性（P<0.05）,但对携带rs1042032A/rs1042064 T单倍型质粒报告基因的活性无影响。miR一146a模拟物转染HUVEC可剂量依赖性升高HUVEC内miR-146a的水平,但不影响HUVEC内EPHX2mRNA表达。结论：1)EPHX2 rs1042032多态性AA可增加长沙地区汉族人群血管病变所致IS及高脂血症患者IS的发病风险；2)miR-146ars2910164多态性CC基因型可能增加长沙地区汉族人群AS所致IS的发病风险；3) EPHX2 rs 1042032位点风险基因型AA与miR-146a rs2910164位点风险基因型CC存在联合作用,共同增加长沙地区汉族人群IS的发病风险；4)IS患者PBMC中rniR-146a和EPHX2 mRNA表达水平间呈负相关：5)miR-146a rs1042032 CC基因型IS患者PBMC中miR-146a表达升高,与IS发病风险增加有关的联合基因型rs 1042032AA/rs1042032 CC与IS患者PBMC中miR一146a表达升高及EPHX2 mRNA表达下降有关。6)EPHX2rs1042032和rs1042064多态性中至少有一个为功能性SNP；7)EPHX2是miR-146a新的靶基因,miR一146a对EPHX2的抑制作用与其rs1042032/rs1042064多态性有关。