利用定向进化提高酰基肽水解酶及糖基转移酶的催化活力

论文摘要

自上世纪90年代以来,定向进化技术作为一种体外优化蛋白质性质的方法,取得了令人瞩目的成就。定向进化技术将基因突变和高通量筛选相结合,在实验室中模拟自然进化中的关键步骤:突变、重组和筛选,加快了分子进化过程,能在短期内获得具有优良性质的突变酶;同时,对突变体性质变化的结构基础和分子机理进行分析,加深了对蛋白质结构-功能关系的理解,因此定向进化技术也成为人类获取蛋白质化学知识的重要途径之一。本文选定两种具有重要研究及应用价值的酶:嗜热酰基肽水解酶及糖基转移酶作为研究对象,运用定向进化对其性质进行优化,并通过对突变体的酶学性质表征、计算机同源建模、分子动力学模拟等技术对突变体性质变化的分子机制进行了深入的探讨。（一）通过对来自嗜热古菌Aeropyrum pernix K1的超嗜热酰基肽水解酶apAPH进行结构分析发现,其活性中心附近的Arg526在POP家族中高度保守,但在与其相关的脂肪酶家族成员中的对应位点均为疏水残基。为了探讨该位点对于酶催化及底物选择性的重要作用,我们运用半理性设计策略构建了526位点的饱和突变库,通过筛选获得了底物选择性发生重大变化的突变体,并且通过酶动力学及计算生物学手段阐明了526位点对于肽酶/酯酶活力转换的重要作用,揭示了蛋白酶及脂肪酶家族的进化相关性;进一步的结构分析显示,Arg526参与到了apAPH催化活性中心附近的离子网络中,与推进器结构域上的Glu88形成了一对保守的、跨结构域的盐桥。为了阐明这个盐桥对于酶催化的影响及其在酶家族中保守的原因,我们针对Glu88和Arg526位点设计了一系列盐桥突变体,通过定点突变、酶动力学和计算生物学等手段,证明了Glu88-Arg526这对跨结构域盐桥对于酶的催化功能及保持酶在高温下的正确折叠具有重要作用。（二）我们以来自于Campylobacter jejuni的β-1,3-糖基转移酶CgtB为模型,建立了针对糖基转移酶的超高通量筛选方法（>108克隆/天）,是目前唯一可以对糖基转移酶活力进行高效筛选的方法,为这个重要的酶家族的定向进化提供了强有力的工具。应用此种筛选方法,我们成功地提高了CgtB的催化活力。最优突变体的相对活力比野生型提高了28倍。酶动力学分析表明,进化突变体的Km值均较野生型明显下降,即突变体通过提高酶与底物的结合力,促进了酶催化的进行。

论文目录

• 提要
• 第一章 前言
• 1.1 蛋白质工程方法简介
• 1.1.1 蛋白质的理性设计
• 1.1.1.1 针对关键氨基酸残基的酶理性设计
• 1.1.1.2 酶分子基本骨架微调
• 1.1.1.3 酶分子结构元件嫁接
• 1.1.2 蛋白质非理性设计——定向进化
• 1.1.2.1 定向进化的原理及目的
• 1.1.2.2 定向进化中突变文库的构建方法
• 1.1.2.3 突变基因的筛选和选择
• 1.1.3 蛋白质的半理性设计
• 1.1.3.1 特定区域突变
• 1.1.3.2 随机突变后的定点饱和突变
• 1.1.3.3 计算机辅助的半理性设计
• 1.2 酰基肽水解酶apAPH 简介
• 1.2.1 脯氨酸寡肽酶家族简介
• 1.2.2 超嗜热酰基肽水解酶apAPH 简介
• 1.2.3 apAPH 的潜在应用价值
• 1.2.3.1 手性化合物拆分
• 1.2.3.2 聚酯合成
• 1.2.3.3 作为检测环境中有机磷毒物的生物标志物
• 1.2.4 apAPH 的定向进化研究
• 1.3 β-1,3-糖基转移酶CgtB 简介
• 1.3.1 糖基转移酶家族简介
• 1.3.1.1 糖基转移酶家族
• 1.3.1.2 糖基转移酶结构特征
• 1.3.1.3 糖基转移酶的分类
• 1.3.1.4 糖基转移酶的催化机制
• 1.3.2 β-1,3-糖基转移酶CgtB 简介
• 1.3.3 CgtB 的工业应用潜力
• 1.3.3.1 肿瘤相关T 抗原的合成
• 1 类神经节苷脂的合成'>1.3.3.2 GM₁类神经节苷脂的合成
• 1.3.4 糖基转移酶的定向进化
• 1.4 本论文立项依据和实验流程设计
• 1.5 参考文献
• 第二章 超嗜热酰基肽水解酶/酯酶的半理性设计
• 2.1 引言
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 同源序列比对
• 2.2.2 蛋白质三级结构比对
• 2.2.3 全质粒PCR 构建定点饱和突变库
• 2.2.4 饱和突变库的筛选
• 2.2.5 野生型apAPH 及其突变体的表达及粗酶获得
• 2.2.6 野生型apAPH 及其突变体的镍亲和柱纯化
• 2.2.7 酯酶、肽酶活力测定
• 2.2.8 动力学常数测定
• 2.2.9 野生型apAPH 及突变体底物复合物模型构建
• 2.2.10 分子动力学模拟（MDS）
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 半理性设计思路的确立及突变位点选择
• 2.3.2 Arg526 饱和突变库的建立及筛选
• 2.3.3 突变体的纯化与性质鉴定
• 2.3.5 计算机建模
• 2.3.6 分子动力学模拟
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 2.6 参考文献
• 第三章 跨结构域盐桥对apAPH 酶活性和稳定性的调节作用
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 定点突变体的构建
• 3.2.2 野生型apAPH 及其突变体的表达、纯化
• 3.2.3 动力学常数测定
• 3.2.4 最适pH 和催化基团解离常数的测定
• 3.2.5 无机盐对酶活力的影响
• 3.2.6 不同浓度磷酸缓冲液和NaCl 对酶活力的影响
• 3.2.7 温度对酶催化的影响及催化热力学的测定
• 3.2.8 酶热稳定动力学的测定
• 3.2.9 差式扫描量热（DSC）测定酶变性温度
• 3.2.10 酶在盐酸胍中的变性过程测定
• 3.2.11 野生型apAPH 及突变体底物复合物模型构建
• 3.2.12 野生型apAPH 及突变体的分子动力学模拟（MDS）
• 3.3 实验结果及讨论
• 3.3.1 跨结构域盐桥突变体的设计及活性变化
• 3.3.2 离子强度对酶活性的影响
• 3.3.3 pH 对酶活性的影响
• 3.3.4 温度对酶催化的影响及突变体分子柔性的变化
• 3.3.5 热稳定性的变化
• 3.3.6 野生型apAPH 及突变体的分子动力学模拟
• 3.4 小结
• 3.5 参考文献
• 第四章 β-1，3-糖基转移酶的定向进化研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 随机突变库的构建
• 4.2.2 DNA 改组突变库的构建
• 4.2.3 CgtB 活力的高通量筛选
• 4.2.4 CgtB 定点突变体的构建
• 4.2.5 CgtB 在大肠杆菌的过量表达及蛋白质纯化
• 4.2.6 糖基转移酶活力测定
• 4.2.7 CgtB 野生型及其突变体的动力学常数测定
• 4.3 实验结果及讨论
• 4.3.1 高通量筛选方法的建立
• 4.3.1.1 FACS 筛选的策略及底物分子设计
• 4.3.1.2 高通量筛选方法的建立
• 4.3.2 随机突变库的建立及筛选
• 4.3.2.1 随机突变库的建立
• 4.3.2.2 随机突变库的筛选
• 4.3.3 基因改组突变库的建立及筛选
• 4.3.3.1 基因改组突变库的建立
• 4.3.3.2 基因改组突变库的筛选
• 4.3.4 CgtB 定点突变体的设计与构建、表达、纯化
• 4.3.4.1 定点突变体的设计与构建
• 4.3.4.2 突变体的表达与纯化
• 4.3.4.3 突变体的活力变化
• 4.3.4.4 突变体的动力学常数测定
• 4.4 小结
• 4.5 参考文献
• 创新点
• 作者简历
• 博士期间已发表和待发表的文章
• 负责或参与的研究课题
• 致谢
• 摘要
• Abstract