鸦胆子（Brucea javanica）活性物质对烟草花叶病毒的抑制作用机理及构效关系分析

论文摘要

利用抗烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）活性跟踪的方法,采用柱层析（DCC）、薄层层析（TLC）和高效液相色谱（HPLC）等分离手段,从传统中药鸦胆子（Brucea javanica（Linn.）Merr.）种子中分离到14个单体化合物,经波谱学鉴定结构,其中5个为苦木苦味素类化合物（Quassinoids）。结合从臭椿（Ailanthus altissima（Mill.）Swingle）根皮中分离到的3个quassinoids,分别利用半叶法和叶碟法测定了其抗TMV侵染和增殖活性,对活性较高的quassinoids,测定了其抗TMV侵染和增殖的抑制中浓度(EC50),并利用半叶法测定了其抗黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）和马铃薯Y病毒（Potatovirus Y,PVY）侵染的活性,在此基础上对quassinoids抗植物病毒构效关系（Structure-activity relationship,SAR）进行了分析。结果表明,从鸦胆子中分离到的5个quassinoids中,化合物1—4具有较高抗植物病毒活性,并呈现剂量-活性相关性,其抗TMV侵染EC50分别为13.7μg/mL、22.8μg/mL、30.2μg/mL和13.7μg/mL,抗TMV增殖EC50分别为2.1μg/mL、24.3μg/mL、28.4μg/mL和19.7μg/mL,且所有quassinoids表现了与抗TMV相似的抗CMV和PVY侵染活性。化合物1和2的得率较高,分别为每50 g鸦胆子乙醇提取物乙酸乙酯萃取物中分离到210 mg和2.2 g。根据化合物得率及抗病毒活性,证明化合物1和2为鸦胆子中抗植物病毒主要活性成分。SAR分析表明,抗植物病毒是quassinoids的又一新的生物活性,且其D环中的甲氧桥的位置以及C-15位的酯链的改变是影响化合物的抗植物病毒活性的主要因素,氢键的数量也可能会影响quassinoids的抗病毒活性。体外作用机制研究表明,quassinoids能够通过与TMV外壳蛋白（Coatprotein,CP）及核酸可逆地结合阻止其在寄主表面侵染位点的建立,但并不破坏病毒粒体结构及降解核酸;此外,quassinoids还能够影响TMV-CP体外聚合作用,干扰病毒粒体的正常装配。从感染TMV的发病烟草叶片中提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到其运动蛋白（Movement protein,MP）基因,将扩增产物克隆到pMD18-T载体上,DNA序列分析表明,所得MP基因全长为807 bp,与已报告的TMV-U1株系核苷酸和氨基酸同源性均为100%。将目的基因亚克隆到原核表达载体pET-29a上,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导4 h后蛋白表达量达到最大,超声波显示所得融合蛋白以不可溶形式存在。SDS-PAGE检测蛋白表达情况,表达产物与目的蛋白大小一致,割胶免疫注射家兔得到抗体,ELISA测定效价为25,600,western-blot检测证明运动蛋白在烟草叶片被侵染早期得到表达,且抗体特异性良好。采用real time-PCR、semi-quantative RT-PCR、indirect-ELISA和western-blot等方法在植株和细胞水平研究了以Bruceine D为代表的quassinoids抑制TMV在寄主体内增殖的作用机制。结果表明,quassinoids能够通过抑制TMV基因组RNA及亚基因组RNA（subgenomic RNA,sgRNA）的复制,阻止TMV相关蛋白如CP和MP在寄主体内的表达,从而抑制了TMV的细胞间移动和在寄主体内的长距离运输,延迟了TMV感染造成的花叶症状的产生;同时,研究还发现,quassinoids对TMV在寄主体内增殖的抑制作用随着TMV感染和施药之间时间的增加而降低,表明该类化合物主要作用于病毒侵染的早期,即越早施药,抑制作用越明显。Bruceine D能够系统性地诱导烟草体内POD、PPO、PAL、SOD和β-1,3-glucanase等防御酶的活性的增强,还能够诱导烟草产生1—2条健叶和病叶对照中所没有的POD和PPO同工酶谱带,说明Bruceine D对烟草体内相关防御酶活性具有诱导作用;Bruceine D能够降低被TMV感染叶片中膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）的含量,以及阻止TMV感染造成的烟草叶绿素（叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素）、可溶性糖和可溶性蛋白含量的降低,还能够诱导烟草产生两条不同于TMV感染诱导产生的病程相关蛋白（pathogenesis related proteins,PRP）,对烟草具有保护作用。利用real time-PCR和indirect-ELISA技术对Bruceine D抑制CMV基因组及sgRNAs和病毒粒体在寄主假酸浆（Nicandra physalodes（L.）Gaertner）体内的增殖作用进行了研究。结果表明,虽然Bruceine D能够体外钝化CMV,阻止其侵染寄主,但在CMV侵染寄主后,Bruceine D不能阻止其在寄主体内的增殖。说明quassinoids对正单链RNA（Positive single strand RNA,+ssRNA）植物病毒的体外抑制侵染和体内抑制增殖可能存在不同的作用机制。为进一步明确三萜类化合物对植物病毒的抑制作用,在200μg/mL的供试浓度下对67种植物源三萜及三萜皂甙类化合物的抗TMV增殖活性进行了筛选,并根据其化学结构进行了SAR分析,同时对活性较高的10个化合物进行了EC50测定。结果表明,大多数供试化合物表现了一定的抗病毒活性,该类化合物的活性不仅决定于其主体结构也受取代基团的影响,对于熊果酸型化合物来讲,C-20和C-28位形成的内酯,C-3位的阿拉伯糖,以及C-28位的葡萄糖对活性都产生巨大影响;而对于齐敦果酸型化合物来讲,C-19位的α-羟基,C-3位的木糖以及C-28位的葡萄糖也是影响活性的主要因素。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 烟草花叶病毒（TMV）研究概况
• 1.1.1 TMV粒体及基因组结构与功能
• 1.1.1.1 TMV基因组及其编码的126kD、183kD和54kD蛋白
• 2 sgRNA及其编码的MP'>1.1.1.2 TMV Ⅰ₂sgRNA及其编码的MP
• 1.1.1.3 TMV-CP sgRNA及其编码的CP
• 1.1.2 TMV的侵染生物学
• 1.1.2.1 TMV的侵染和复制
• 1.1.2.2 TMV病毒粒体的自我组装
• 1.2 黄瓜花叶病毒（CMV）研究概况
• 1.2.1 CMV的分类
• 1.2.2 CMV粒体及基因组结构特点
• 1.2.3 CMV各基因组及亚基因组的特点及所编码的蛋白
• 1.2.4 CMV的侵染循环
• 1.3 抗TMV植物源小分子活性成分的研究概况
• 1.3.1 生物碱类物质
• 1.3.2 黄酮类物质
• 1.3.3 精油类物质
• 1.3.4 其他小分子活性物质
• 1.4 鸦胆子主要成分
• 1.4.1 苦木苦味素类化合物（Quassinoids）
• 1.4.2 酸类成分
• 1.4.3 生物碱
• 1.4.4 酚性成分
• 1.5 Quassinoids及其生物活性
• 1.5.1 抗病毒活性
• 1.5.2 抗肿瘤活性
• 1.5.3 抗疟活性
• 1.5.4 其他生物活性
• 1.6 三萜类化合物的生物活性研究
• 1.7 抗病毒活性成分抗烟草花叶病毒作用机理研究概况
• 1.7.1 抑制病毒侵染
• 1.7.1.1 与病毒粒子结合影响侵染位点的建立
• 1.7.1.2 破坏病毒粒子的完整性
• 1.7.1.3 在寄主表面形成保护层
• 1.7.2 抑制病毒增殖
• 1.7.2.1 阻止病毒核酸与寄主核糖体结合
• 1.7.2.2 影响病毒相关蛋白和核酸的合成以及病毒的装配
• 1.7.3 诱导寄主抗病性
• 1.7.4 作用于传毒介体
• 1.8 本研究的目的、意义及技术路线
• 2 鸦胆子活性成分的分离鉴定、抗病毒活性测定及构效关系分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 实验仪器
• 2.1.1.2 药品及溶剂
• 2.1.1.3 供试寄主、供试毒源及抗体
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.2.1 TMV的分离纯化
• 2.1.2.2 提纯病毒的电镜观察及浓度计算
• 2.1.2.3 TMV抗血清的制备
• 2.1.2.4 TMV抗血清效价测定
• 2.1.2.5 抗体适宜工作浓度测定
• 2.1.2.6 化合物抗病毒侵染活性测定
• 2.1.2.7 化合物抗病毒增殖活性测定
• 50)的计算'>2.1.2.8 化合物抗TMV抑制中浓度(EC₅₀)的计算
• 2.1.2.9 鸦胆子活性成分的提取分离及结构鉴定
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 提纯病毒的电镜观察
• 2.2.2 提纯病毒的浓度
• 2.2.3 抗血清的效价
• 2.2.4 抗体的适宜工作浓度
• 2.2.5 TMV浓度曲线
• 2.2.6 鸦胆子中quassinoids的结构鉴定
• 2.2.6.1 化合物1
• 2.2.6.2 化合物2
• 2.2.6.3 化合物3
• 2.2.6.4 化合物4
• 2.2.6.5 化合物5
• 2.2.7 臭椿中三种quassinoids结构
• 2.2.7.1 化合物6
• 2.2.7.2 化合物7
• 2.2.7.3 化合物8
• 2.2.8 其他化合物
• 2.2.9 Quassinoids抗TMV活性及抑制中浓度
• 2.2.10 化合物1—8抗CMV和PVY侵染活性
• 2.2.11 Quassinoids抗植物病毒SAR分析
• 2.2.12 化合物9—17抗TMV活性
• 2.3 讨论
• 3 TMV-MP的表达及特异性抗体制备
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 TMV病毒及试剂
• 3.1.2 主要实验仪器
• 3.1.3 试验动物
• 3.1.4 菌株和质粒
• 3.1.5 PCR引物合成
• 3.1.6 病叶总RNA提取及RT-PCR反应
• 3.1.6.1 病叶总RNA的提取
• 3.1.6.2 cDNA合成
• 3.1.6.3 PCR扩增
• 3.1.6.4 PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳及回收
• 3.1.7 大肠杆菌克隆载体的构建
• 3.1.7.1 PCR扩增产物与pMD18-T克隆载体的连接
• 3.1.7.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.1.7.3 连接产物或重组质粒转化
• 3.1.7.4 质粒提取
• 3.1.7.5 重组克隆质粒的双酶切鉴定
• 3.1.7.6 重组克隆质粒的PCR鉴定
• 3.1.8 原核表达载体的构建
• 3.1.9 序列测定与分析
• 3.1.10 融合蛋白的表达
• 3.1.11 表达产物的可溶性分析
• 3.1.12 融合蛋白抗血清的制备
• 3.1.13 抗血清效价及被感染烟草叶片内的TMV-MP检测
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 TMV-MP基因的PCR扩增结果
• 3.2.2 TMV-MP基因克隆载体的酶切鉴定
• 3.2.3 TMV-MP表达载体的构建
• 3.2.4 TMV-MP融合蛋白的表达
• 3.2.4.1 融合蛋白的分子量预测
• 3.2.4.2 融合蛋白的诱导表达
• 3.2.4.3 融合蛋白的可溶性分析
• 3.2.5 抗血清的制备及效价测定
• 3.2.6 抗血清效价及被感染烟草叶片内的TMV-MP检测
• 3.3 讨论
• 4 Quassinoids体外抗TMV侵染机理
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试寄主、供试毒源及供试植物
• 4.1.2 Quassinoids对TMV粒子的直接作用
• 4.1.3 透析处理对quassinoids化合物抗TMV活性的影响
• 4.1.4 TMV粒体与quassinoids结合的紫外检测
• 4.1.5 TMV外壳蛋白的提纯
• 4.1.6 对TMV-CP体外聚合作用的影响
• 4.1.7 TMV-RNA的制备及检测
• 4.1.8 Quassinoids对TMV-RNA的作用
• 4.2 结果
• 4.2.1 Quassinoids对TMV粒体结构的影响
• 4.2.2 透析处理后两种提取物的抗病毒作用
• 4.2.3 Quassinoids与TMV结合情况的紫外扫描
• 4.2.4 Quassinoids对TMV-CP体外聚合作用的影响
• 4.2.5 Quassinoids对TMV-RNA的作用
• 4.3 讨论
• 5 Bruceine D抗TMV增殖机理
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试寄主、供试毒源及供试植物
• 5.1.2 供试仪器和试剂
• 5.1.3 Bruceine D对TMV核酸复制影响的real time-PCR检测
• 5.1.3.1 BruceineD对TMV基因组及亚基因组复制的影响
• 5.1.3.2 引物的合成
• 5.1.3.3 RNA的反转录及PCR反应
• 5.1.3.4 目的基因及内参基因标准曲线的建立
• 5.1.3.5 处理及未处理样品中目的基因的相对定量
• 5.1.3.6 Bruceine D处理后不同时间段对TMV基因组复制的影响
• 5.1.3.7 Bruceine D对TMV基因组RNA在寄主体内移动的影响
• 5.1.4 半定量PCR检测Bruceine D对TMV基因组RNA复制的影响
• 5.1.4.1 处理及检测
• 5.1.4.2 半定量RT-PCR引物合成
• 5.1.4.3 半定量RT-PCR条件的优化
• 5.1.5 Bruceine D对TMV-CP合成的影响
• 5.1.6 Bruceine D对TMV在寄主植株中移动及症状表现的影响
• 5.1.7 Bruceine D对接种后不同时间段TMV-CP表达情况的影响
• 5.1.8 接种病毒不同时间后Bruceine D对TMV-CP的抑制作用
• 5.1.9 Bruceine D对TMV-MP合成的影响
• 5.1.10 BruceineD在细胞水平对TMV增殖的影响
• 326愈伤组织的制备'>5.1.10.1 普通烟K₃₂₆愈伤组织的制备
• 5.1.10.2 悬浮细胞的制备
• 5.1.10.3 TMV接种烟草悬浮细胞
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 Bruceine D处理48 h对TMV基因组及亚基因组复制的影响
• 5.2.1.1 目的基因和内参基因的PCR扩增产物电泳分析
• 5.2.1.2 目的基因和内参基因的融解曲线分析
• 5.2.1.3 目的基因和内参基因的PCR扩增曲线
• 5.2.1.4 目的基因和内参基因的标准曲线
• 5.2.1.5 目的基因与管家基因的原始定量结果
• 5.2.1.6 目的基因与管家基因的相对定量结果
• 5.2.2 Bruceine D在接种后不同时间对TMV基因组RNA复制的影响
• 5.2.2.1 目的基因与管家基因real time-PCR扩增曲线
• 5.2.2.2 目的基因和内参基因的标准曲线
• 5.2.2.3 目的基因与管家基因的原始定量结果
• 5.2.2.4 目的基因与管家基因的相对定量结果
• 5.2.3 Bruceine D对TMV-RNA在寄主体内移动的影响
• 5.2.3.1 目的基因和内参基因的PCR扩增曲线
• 5.2.3.2 目的基因和内参基因的标准曲线
• 5.2.3.3 目的基因与管家基因的原始定量结果
• 5.2.3.4 目的基因与管家基因的相对定量结果
• 5.2.4 接种不同时间段Bruceine D对TMV基因组RNA复制的影响
• 5.2.4.1 半定量RT-PCR条件的优化
• 5.2.4.2 接种不同时间Bruceine D处理对TMV基因组复制的影响
• 5.2.5 Bruceine D对TMV-CP增殖的影响
• 5.2.6 Bruceine D对TMV在寄主植株中移动及症状表现的影响
• 5.2.7 Bruceine D对接种后不同时间段TMV增殖情况的影响
• 5.2.8 接种TMV不同时间后处理对TMV增殖的影响
• 5.2.9 Bruceine D对TMV-MP表达的影响
• 5.2.10 Bruceine D在细胞水平对TMV增殖的抑制情况
• 5.2.10.1 TMV侵染及Bruceine D处理对悬浮细胞的影响
• 5.2.10.2 Bruceine D处理后不同时间段对TMV在细胞内增殖影响
• 5.3 讨论
• 5.3.1 real time-PCR检测Bruceine D对TMV基因组RNA复制的影响
• 5.3.2 半定量PCR检测Bruceine D对TMV基因组RNA复制的影响
• 5.3.3 Bruceine D在寄主体内抗TMV增殖的作用机制
• 6 Bruceine D对烟草抗TMV的诱导抗性及免疫作用
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 Bruceine D对烟草相关防御酶活性的测定
• 6.1.2.1 酶液提取
• 6.1.2.2 POD活性测定
• 6.1.2.3 PPO活性测定
• 6.1.2.4 PAL活性测定
• 6.1.2.5 SOD活性测定
• 6.1.2.6 β-1,3-葡聚糖酶的测定
• 6.1.3 Bruceine D对寄主叶绿素、丙二醛及POD、PPO同工酶的影响
• 6.1.3.1 处理和取样
• 6.1.3.2 叶绿素含量的测定
• 6.1.3.3 MDA含量测定
• 6.1.3.4 对PPO、POD两种同工酶的电泳分析
• 6.1.4 Bruceine D对寄主可溶性糖及可溶性蛋白含量的影响
• 6.1.4.1 处理和取样
• 6.1.4.2 采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量
• 6.1.4.3 Bruceine D对寄主可溶性蛋白含量的影响
• 6.1.5 Bruceine D对烟草PR蛋白的诱导
• 6.1.5.1 处理和取样
• 6.1.5.2 PR蛋白的提取及电泳
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 Bruceine D对烟草体内防御酶的影响
• 6.2.1.1 POD活性的变化
• 6.2.1.2 PPO活性的变化
• 6.2.1.3 PAL活性的变化
• 6.2.1.4 SOD活性的变化
• 6.2.1.5 β-1,3-葡聚糖酶活性的变化
• 6.2.2 Bruceine D对烟草叶绿素、MDA及PPO、POD同工酶的影响
• 6.2.2.1 对叶绿素的影响
• 6.2.2.2 对MDA含量的影响
• 6.2.2.3 对PPO、POD同工酶的影响
• 6.2.3 Bruceine D对寄主可溶性糖及可溶性蛋白含量的影响
• 6.2.3.1 可溶性糖标准曲线的绘制
• 6.2.3.2 对寄主可溶性糖含量的影响
• 6.2.3.3 可溶性蛋白标准曲线的绘制
• 6.2.3.4 对寄主可溶性蛋白含量的影响
• 6.2.4 Bruceine D对烟草PR蛋白的诱导
• 6.3 讨论
• 6.3.1 Bruceine D系统性诱导寄主防御酶活性的提高
• 6.3.2 Bruceine D能够保护寄主叶绿体
• 6.3.3 Bruceine D能够诱导烟草产生新的同工酶
• 6.3.4 Bruceine D减轻TMV感染造成的可溶性糖和蛋白含量的降低
• 6.3.5 Bruceine D能诱导烟草产生新的病程相关蛋白
• 7 Bruceine D对CMV在寄主体内增殖的作用
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 供试寄主、供试毒源及供试植物
• 7.1.2 供试仪器和试剂
• 7.1.3 Bruceine D对CMV核酸复制影响的real time-PCR检测
• 7.1.3.1 Bruceine D对CMV基因组及亚基因组复制的影响
• 7.1.3.2 引物的合成
• 7.1.3.3 RNA的反转录反应
• 7.1.3.4 目的基因及内参基因标准曲线的建立
• 7.1.3.5 处理及未处理样品中目的基因的相对定量
• 7.1.4 Bruceine D对CMV病毒粒体在寄主体内增殖的影响
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 目的基因和内参基因的融解曲线分析
• 7.2.2 目的基因和内参基因的PCR扩增曲线
• 7.2.3 目的基因和内参基因的标准曲线
• 7.2.4 目的基因与管家基因的原始定量结果
• 7.2.5 Bruceine D对CMV病毒粒体在寄主体内增殖的影响
• 7.3 讨论
• 8 三萜及三萜皂甙类化合物抗TMV活性及构效关系
• 8.1 材料和方法
• 8.1.1 供试寄主、供试毒源及供试植物
• 8.1.2 三萜类及三萜皂甙类供试化合物
• 8.1.3 三萜及三萜皂甙类化合物抗TMV增殖活性测定
• 8.2 结果与分析
• 8.2.1 67个三萜及三萜皂甙类化合物抗TMV增殖活性
• 8.2.2 活性化合物的抑制中浓度
• 8.3 讨论
• 9 总结与讨论
• 9.1 抗植物病毒是quassinoids的一种新的生物活性
• 9.2 TMV-MP的原核表达及特异性抗体制备
• 9.3 明确了quassinoids体外和体内的抗TMV机制
• 9.4 Quassinoids特异性抑制TMV在寄主体内的增殖
• 9.5 Quassinoids能够诱导寄主抗病性并具有保护作用
• 9.6 进行了quassinoids抗TMV的SAR分析
• 9.7 进行了三萜类化合物抗TMV的SAR分析
• 参考文献
• 附录1 缩略语及含义
• 附录2 攻博期间发表及投稿的论文
• 致谢