微小牛蜱雌蜱唾液腺消减cDNA文库的构建及卵黄蛋白原基因的原核表达

论文摘要

微小牛蜱（Boophilus microplus）是一种世界性分布的一宿主蜱,主要分布于热带和亚热带地区,并因气候的变化在有些国家分布范围扩大。微小牛蜱主要寄生在黄牛和水牛,不仅直接吸血影响动物生产性能,更重要的是可以传播立克次体、森林脑炎、斑疹热、新疆出血热、莱姆病等人畜共患传染病和双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫等寄生虫病,而双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫是引起全球牛巴贝斯病的主要病原,给人类健康和畜牧业生产的发展带来严重威胁。因为蜱在自然界几乎没有天敌,使得蜱的防控非常困难,目前,对蜱的主要防控手段为蜱螨杀虫剂,然而长期使用杀虫剂的弊端日益明显,如环境污染、耐药性产生、肉奶中药物残留等,另外,新的杀虫剂的研发也是件长期而耗资巨大的工程。Bm86为抗原成分的疫苗的问世开辟了人们用免疫方法预防蜱及蜱传病的先河。本研究以我国微小牛蜱半饱血雌性成蜱唾液腺cDNA为Tester,饥饿雌性成蜱cDNA为Driver,采用抑制消减杂交技术和T/A克隆技术构建了微小牛蜱半饱血雌性成蜱唾液腺消减cDNA文库。对获得的158个阳性斑进行PCR鉴定,显示插入片段主要集中在200 bp-550 bp之间,挑取60个白斑克隆进行测序,共获得了12个有效ESTs,生物信息学分析推测,它们所编码的功能性蛋白包括卵黄蛋白原、基质蛋白、富含脯氨酸蛋白质、OTM-3假定蛋白等。根据基因序列设计引物,以微小牛蜱基因组DNA为模板,对所得ESTs进行鉴定,证明它们都是微小牛蜱所固有。另外,从微小牛蜱唾液腺消减杂交cDNA文库中分离到的卵黄蛋白原基因序列为模板,设计特异性表达引物扩增出627 bp的片段,扩增产物连入pGEX-4T-1表达载体后转入BL21 （DE3）感受态细胞进行表达。结果显示,表达出大小49.4kD、包涵体形式的融合蛋白,用2M的尿素洗涤包涵体形式的融合蛋白以后,溶于8M的尿素中,用电洗脱的方式进行纯化,对纯化后的蛋白进行电泳分析,基本没有杂带。用Western-blot方法检测表达蛋白有很好的反应原性。微小牛蜱半饱血雌性成蜱唾液腺消减cDNA文库的构建为进一步研究微小牛蜱唾液腺差异表达基因奠定了基础,卵黄蛋白原基因的成功表达和免疫原性的检测为分子疫苗的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 蜱重要功能分子
• 1.1.1 抗凝血因子
• 1.1.2 免疫调节因子
• 1.1.3 抗生物肽
• 1.1.4 代谢相关分子
• 1.1.5 运载蛋白类
• 1.1.6 蜱的其他功能性分子
• 1.2 蜱功能基因筛选方法
• 1.2.1 基于基因序列保守区的筛选
• 1.2.2 基于cDNA表达文库的筛选
• 1.2.3 基于cDNA全长文库的筛选
• 1.2.4 基于差异表达消减文库的筛选
• 1.3 研究的目的和意义
• 第二章 微小牛蜱雌蜱唾液腺消减cDNA文库的构建与鉴定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 总RNA和mRNA的质量检测
• 2.2.2 套式PCR
• 2.2.4 消减文库的PCR初步鉴定、测序及BLAST分析
• 2.2.5 获得ESTs的鉴定
• 2.3 讨论
• 第三章 卵黄蛋白原的克隆与原核表达
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 目的片段的PCR扩增
• 3.2.2 重组质粒pGEX-4T-1-Vg的鉴定
• 3.2.3 重组质粒的测序鉴定
• 3.2.4 表达产物的SDS-PAGE分析
• 3.2.5 融合蛋白表达形式鉴定结果
• 3.2.6 GST蛋白小量纯化试剂盒纯化融合蛋白结果
• 3.2.7 融合蛋白电洗脱纯化结果
• 3.2.8 Western-blot检测结果
• 3.3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历