低氧微环境下内皮细胞自噬与凋亡之间作用的研究

论文摘要

第一部分：低氧微环境对内皮细胞自噬的诱导目的：低氧微环境在肿瘤组织的生长、代谢以及耐药过程中发挥着重要的作用。然而,肿瘤细胞以及肿瘤组织中的内皮细胞逃避低氧微环境对其损害的机理尚未完全明了。本研究拟初步探讨低氧微环境下内皮细胞自噬的发生及其机制。方法：通过三气培养箱建立低氧微环境；通过透射电镜检测低氧微环境下培养的内皮细胞内是否出现自噬小体；RT-PCR法检测低氧条件下自噬相关基因的表达；激光共聚焦显微镜检测自噬小体表面微管相关蛋白1的轻链3（LC3）的表达、单丹（磺）酰戊二胺（MDC）染色法以及吖啶橙染色法定量检测不同长度的低氧时间下自噬小体数目,统计学分析低氧微环境与内皮细胞自噬之间的关系。结果：透射电镜检测显示,低氧微环境培养下的内皮细胞内能够观察到自噬小体的存在,表现为空泡样双层膜结构,电子密度高,提示低氧微环境能够诱导内皮细胞自噬的产生。RT-PCR结果显示,低氧条件下,内皮细胞自噬相关基因的表达上调；激光共聚焦显微镜检测显示,低氧条件下培养的内皮细胞内,含LC3-GFP颗粒的自噬小体明显增多,与低氧微环境具有相关性。MDC以及吖啶橙染色法显示,随着低氧时间的延长,细胞内自噬小体的出现明显增加,自噬与低氧时间之间存在有相关性,且低氧诱导的自噬具有可逆性。结论：低氧微环境能够诱导内皮细胞发生自噬,且这一现象与低氧时间之间存在有相关性。第二部分低氧微环境诱导内皮细胞自噬的调控通路目的：调控自噬的分子机制分为依赖mTOR以及非依赖mTOR的分子通路。本研究拟通过应用classⅢPI3K的抑制剂3-MA、mTOR的抑制剂雷帕霉素以及MPKAp38抑制剂SB202190,探讨调控低氧微环境下内皮细胞自噬的分子机制。方法：通过三气培养箱建立低氧微环境；体外通过P13K的特异性抑制剂3-MA、mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素以及MPKAp38的特异性抑制剂SB202190干预内皮细胞,激光共聚焦显微镜检测自噬小体表面微管相关蛋白1的轻链3（LC3）的表达、单丹（磺）酰戊二胺（MDC）染色法以及吖啶橙染色法定量各处理组自噬小体的数量,统计学分析三种不同类型抑制剂与内皮细胞自噬之间的关系。结果：免疫印迹法检测显示,雷帕霉素能够降低mTOR的磷酸化水平,SB202190能够抑制MAPKp38的磷酸化。在应用三种不同类型的抑制剂后,激光共聚焦显微镜检测显示,3-MA处理组内皮细胞内含LC3的自噬小体数量明显减少,而雷帕霉素处理组内皮细胞内的自噬小体数量明显增加,SB202190处理组内皮细胞内自噬小体的数量没有明显变化。MDC染色以及吖啶橙染色法同样提示3-MA能够抑制内皮细胞内自噬小体的产生,而雷帕霉素则会增强自噬活性,SB202190则没有这样的作用。结论：classⅢPI3K参与调解低氧微环境下内皮细胞自噬的正性,而mTOR/classⅠPI3K/Akt通路则对低氧条件下的内皮细胞的自噬具有负性调节作用,而MAPKp38通路则对这一过程没有影响。第三部分低氧诱导自噬对内皮细胞凋亡的影响目的：低氧微环境下,内皮细胞同时存在凋亡与自噬两种程序性细胞死亡方式。本研究拟通过采用自噬特异性抑制剂3-MA,探讨自噬对内皮细胞凋亡的影响。方法：通过三气培养箱建立低氧微环境；体外采用自噬特异性抑制剂作用内皮细胞后,流式细胞仪检测内皮细胞的凋亡水平,caspase-8、caspase-9活性试剂盒检测细胞凋亡的调控通路；采用caspase活性抑制剂Z-DEVD-FMK作用内皮细胞后,MDC染色法检测细胞自噬水平的变化；Transwell小室迁移法以及鬼笔环肽染色法检测抑制内皮细胞自噬后,细胞的功能改变。结果：流式细胞仪检测显示,采用3-MA抑制内皮细胞的自噬发生后,细胞的凋亡水平明显上升；caspase-8、caspase-9活性检测提示,采用3-MA抑制以后,caspase-8的活性未见明显变化,而caspase-9的活性则明显升高,提示自噬抑制内皮细胞凋亡主要通过线粒体调控通路进行；采用transwell小室迁移法以及鬼笔环肽检测内皮细胞的功能,结果显示,采用3-MA抑制细胞自噬以后,内皮细胞的迁移能力明显增强,细胞内肌丝明显增多。MDC染色法显示,采用caspase酶活性抑制剂Z-DEVD-FMK作用细胞后,细胞的自噬水平并无改变,提示细胞凋亡对自噬没有调控作用。结论：低氧微环境下,自噬能够避免内皮细胞进入凋亡途径,抑制内皮细胞的功能。

论文目录

• 英文缩略词
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 低氧微环境诱导内皮细胞自噬现象的发生与检测
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 低氧微环境诱导内皮细胞自噬的分子机制
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 低氧诱导内皮细胞的自噬与凋亡的关系
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢