长白山温泉嗜热微生物的分离鉴定及新型嗜热脂肪酶性质研究

论文摘要

近年来,嗜热微生物特殊的生理生化特征和嗜热酶独特的生物稳定性和催化活性得到科学研究者的关注,推动了酶学和酶工程理论的发展,为酶的工业应用奠定了基础。地球上地热高温环境蕴藏着大量的嗜热微生物资源,30年来已经有超过80个新属150种嗜热菌被分离鉴定。中国是世界上地热环境最丰富的国家之一,然而对于具有“温泉之最”之称的长白山温泉的研究却几乎为空白。长白山独特的火山地质地貌及其特殊的地理环境决定了它是一个非常原始的生态系统,众多的高温温泉蕴藏着丰富的嗜热微生物和基因资源。本论文以长白山温泉为考察对象,分离鉴定长白山温泉嗜热微生物,克隆、表达嗜热脂肪酶基因,并系统研究新型嗜热脂肪酶性质。根据长白山温泉多发性特点,采集不同温度温泉区的土样和水样,利用选择性嗜热菌培养基富集培养样品;通过传统的平板分离,结合梯度稀释的方法成功分离9株不同嗜热程度的嗜热菌。16S rRNA序列同源性比对和系统发育学分析表明它们分属于两个嗜热细菌科中的三个属。对其中的两株潜在新种进行了系统的多相分类学鉴定,结果表明它们是Fervidobacterium属中的新种,,因此建议将菌株CBS-1T和CBS-4T归于超嗜热细菌Fervidobacterium属中的两个新种,分别推荐命名为Fervidobacterium changbaicun和Fervidobacterium tianchisum,标准菌株CBS-1T（=DSM17883T=JCM13353T）,CBS-4T （=JCM14752T）。以F. changbaicum CBS-1基因组为模板,以设计的系列保守脂肪酶氧离子洞和丝氨酸活性部位区域的核苷酸作为引物,随机组合进行PCR;通过Genome walking和巢式PCR后进行序列组装,成功地获得了嗜热脂肪酶基因CF7F。序列同源性分析表明它与已知存在的脂肪酶基因的同源性低于30%,与脂解酶家族V的成员具有相对高的相似性。该脂肪酶是第一个来自超嗜热微生物的脂肪酶。对重组酶进行了系统的酶学性质表征及稳定性机制研究,结果表明该脂肪酶的最适温度为78℃,最适pH为7.8,具有高热稳定性,广泛的pH耐受性以及较宽的底物谱,该酶为超嗜热细菌科Thermotogaceae中的第一个被系统表征的脂肪酶,其高稳定性和广谱底物的催化特性表明它是一个具有工业应用潜力的新型嗜热脂肪酶。

论文目录

• 内容提要
• 第一章 前言
• 1.1 细菌分类学和多相分类学
• 1.1.1 细菌分类学研究进展
• 1.1.2 细菌分类学中种的概念
• 1.1.3 系统发育学研究进展
• 1.1.4 细菌的多相分类学研究
• 1.2 嗜热细菌的研究背景及其分类学
• 1.2.1 极端微生物及嗜热微生物简介
• 1.2.2 嗜热菌分类学研究简史
• 1.2.3 嗜热菌的应用价值
• 1.3 脂肪酶及嗜热脂肪酶
• 1.3.1 脂肪酶
• 1.3.2 嗜热脂肪酶及其研究现状
• 1.3.3 脂肪酶基因的克隆
• 1.4 立题依据和实验设计
• 第二章 长白山温泉可培养微生物的分离及初步鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 溶液配制
• 2.2.2 样品的采集及其环境
• 2.2.3 菌株分离及保藏
• 2.2.4 16S rRNA基因的获得
• 2.2.5 序列比对及系统发育学分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 嗜热菌的富集培养
• 2.3.2 嗜热菌的分离
• 2.3.3 菌株16S rRNA基因扩增、测序及其系统发育学分析
• 2.4 小结
• 第三章 长白山温泉嗜热菌多相分类学研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 溶液配制
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 菌株培养
• 3.2.4 参比菌株
• 3.2.5 表型特征
• 3.2.6 基因型特征
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 菌株CBS-1 和CBS-4 的表型特征
• 3.3.2 基因型特征与系统发育学分析
• 3.4 小结
• 3.5 新种描述
• 3.5.1 Fervidobacterium changbaicum sp. nov
• 3.5.2 Fervidobacterium tianchisum sp. nov
• 第四章 超嗜热细菌F. CHANGBAICUM脂肪酶基因的钓取
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 生物软件及工具
• 4.2.2 脂肪酶数据库
• 4.2.3 脂肪酶一级序列特征及分类
• 4.2.4 脂肪酶探测引物的设计
• 4.2.5 脂肪酶基因片段的钓取
• 4.2.6 嗜热脂肪酶基因全序列的克隆
• 4.2.7 序列同源性分析及进化关系
• 4.2.8 同源模建
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 脂肪酶保守区域的分类
• 4.3.2 脂肪酶探测引物的设计
• 4.3.3 嗜热脂肪酶基因片段的钓取
• 4.3.4 Genome walking克隆CF7 上、下游未知序列
• 4.3.5 CF7 全序列（CF7F）组装及特征分析
• 4.3.6 信号肽序列的预测
• 4.3.7 序列同源性分析及进化关系
• 4.3.8 脂肪酶的同源模建
• 4.4 小结
• 第五章 嗜热脂肪酶基因的克隆、表达及酶学性质表征
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 主要仪器
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 实验用菌株及质粒
• 5.2.4 溶液配制
• 5.2.5 培养基
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 基因组DNA的提取
• 5.3.2 基因的克隆与纯化
• 5.3.3 嗜热脂肪酶基因的表达及粗酶的获得
• 5.3.4 脂肪酶活力测定
• 5.3.5 嗜热脂肪酶的纯化
• 5.3.6 重组嗜热脂肪酶酶学性质表征
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 目的基因的PCR扩增
• 5.4.2 载体制备及重组质粒的构建
• 5.4.3 重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定
• 5.4.4 目的蛋白的表达与纯化
• 5.4.5 重组嗜热脂肪酶基本酶学性质表征
• 5.5 小结
• 第六章 嗜热脂肪酶稳定性机制的研究
• 6.1 引言
• 6.2 实验材料
• 6.2.1 主要仪器
• 6.2.2 主要试剂
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 热失活动力学研究
• 6.3.2 圆二色谱测定
• 6.3.3 荧光光谱测定
• 6.3.4 酶的通透性测定
• 6.3.5 平衡解折叠模型的构建
• 6.3.6 酶在盐酸胍中的活力及复性过程测定
• 6.3.7 氨基酸组成对稳定性的影响
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 嗜热脂肪酶的热稳定性
• 6.4.2 嗜热脂肪酶的pH稳定性
• 6.4.3 变性剂对酶构象的影响
• 6.4.4 氨基酸组成对酶稳定性的影响
• 6.5 小结
• 创新点
• 攻读博士期间研究成果
• 参考文献
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 致谢