肠道病毒71型的检测及初步纯化

论文摘要

手足口病是一种常见的肠道病毒感染引起的疾病,其主要病原体为科萨奇16和肠道病毒71型(EV71),其患者主要是儿童。除了手足口病外,EV71还可引起严重的中枢神经系统疾病,如脑炎、脊髓灰质炎样麻痹。从2008年起,以C4亚型为主要病原体的手足口病在我国大规模爆发,严重影响了人民的健康和生活。到目前为止还没有成熟的EV71快速诊断试剂和预防疫苗,所以研究开发相关诊断试剂与疫苗对于手足口病的诊断和预防具有重要意义。本研究的目的是探索制备EV71的灭活疫苗的实验流程,所做的工作如下:建立针对肠道病毒71型的病毒分离和鉴定技术平台,初步获得符合标准的EV71病毒库;建立EV71鉴定和支原体检测的巢氏PCR法;从EV71收获液中浓缩并初步纯化病毒颗粒。本研究结果将为EV71的预防和控制提供重要工具,打下一定的基础。病毒粪便标本分离后对肠道病毒71型安徽、河南分离株的VP1序列(编码病毒衣壳蛋白的核苷酸序列1)进行测定,参照EV71 A、B、C各基因型的参考株和以往中国EV71的分离株进行同源分析和构建系统发生树。结果表明,所分析的9株病毒株均为C4亚型,H7、H8、H9三株安徽株的VP1序列相似度很高(≥98.8%,其中H7、H9的相似度为100.0%),H3、H4、H5、H6四株河南株相似度很高(≥98.4%,H3、H4、H5≥99.6%,其中H3、H4的相似度为100.0%),它们同H1、H5河南株的相似度也较高(≥97.2%),安徽株H7、H8、H9株变异速率明显加快,这可能导致了手足口病在安徽省的率先爆发与大流行,河南株H2虽然与其它河南株具有较高的序列相似度,但进化分析表明其与安徽株同源性较高,河南株H2最初可能由安徽传入河南。以上研究对于我国EV71的基因归类、分子流行病学研究、EV71的流行规律和EV71引起的相关疾病的治疗和预防都有参考价值。本研究在EV71病毒的分离、鉴定的过程中,建立了EV71鉴别和支原体检测的巢式PCR法。本研究通过EV71病毒的分离、鉴定和纯化,建立了一个具有我国地域性的肠道病毒库,并且初步建立了EV71病毒的大规模培养、破碎、浓缩和初步纯化的一整套工艺,已获得了具有较高滴度和纯度的EV71病毒颗粒,为后期的疫苗研发等工作提供了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 1 引 言
• 1.1 手足口病及肠道病毒71 型的概况
• 1.2 EV71 的生物学特征
• 1.2.1 EV71 的病毒学分类
• 1.2.2 病毒颗粒的形态结构及理化特性
• 1.2.3 EV71 的分子生物学特征
• 1.2.4 病毒的感染、复制及转录
• 1.3 EV71 的流行病学
• 1.3.1 EV71 的流行历史
• 1.3.2 分子流行病学
• 1.3.3 易感人群及临床症状
• 1.3.4 EV71 的传播特征
• 1.4 EV71 的诊断方法
• 1.4.1 病毒的分离培养
• 1.4.2 中和试验
• 1.4.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 1.4.4 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 1.4.5 巢式聚合酶链式反应（nested-PCR）
• 1.4.6 生物芯片技术
• 1.5 EV71 的治疗与预防
• 1.6 毒种的选择和鉴定
• 1.7 蔗糖平衡密度梯度离心法与 EV71 病毒的初纯
• 1.8 本课题研究的目的和意义
• 1.9 实验思路与方案
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞系、病毒株、菌种
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要实验试剂
• 2.1.4 常用试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 病毒的收集和分离
• 2.2.2 EV71 病毒分离株鉴定及同源性分析
• 2.2.3 毒株的纯化和检定
• 2.2.4 病毒的培养及细胞破碎
• 2.2.5 病毒的浓缩
• 2.2.6 病毒的初步纯化
• 3.实验结果与分析
• 3.1 EV71 毒株的分离
• 3.2 毒株的鉴定及同源性分析
• 3.2.1 毒株的鉴定
• 3.2.2 毒株的同源性分析
• 3.3 毒株的纯化与检定
• 3.3.1 毒株的遗传稳定性检定
• 3.3.2 毒株支原体的巢式PCR 检测
• 3.4 病毒的培养及浓缩
• 3.5 病毒浓缩液的初步纯化
• 3.5.1 蔗糖平衡密度梯度离心条件的摸索
• 3.5.2 蔗糖平衡密度梯度离心的放大
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文