索拉非尼对肝癌细胞株HepG2的放疗增敏作用

论文摘要

研究的背景和目的肝癌是我国主要的恶性肿瘤,年发病率为10-150/10万人。在全世界也属于常见病,每年新发原发性肝癌约26万例。我国每年死于肝癌约11万人,占全世界肝癌死亡人数的45%。大多数肝癌患者就诊是已是中晚期,手术率仅有5%-10%左右。随着放射治疗设备与技术的发展,适形放疗技术在临床中的应用,放射治疗已逐渐成为非手术治疗肝癌的主要方法之一。然而,由于肝癌细胞的相对辐射抗拒性,使得肝癌的根治剂量明显高于肝脏的耐受剂量,尤其中晚期肝癌多数有肝病基础,又限制了放疗剂量的提高,导致肝癌放疗效果不佳。因此,如果能选择可以增加肝癌细胞的辐射敏感性（Radiosensitivity）的药物与放疗联合应用,从而相对提高肝脏耐受剂量是提高中晚期肝癌疗效的重要手段之一,在临床应用中具有重要的临床价值。放疗增敏药物的研究,一直都受到关注,早期研究的亲电子类的硝基化合物因毒性大而在临床的应用中受到限制。对放疗增敏机制的进一步的研究发现肿瘤细胞的放射敏感性与细胞内在的分子机制有关,因而对能特异性作用于肿瘤血管生成及信号传导通路的分子靶向治疗药受到重视并成为研究热点,相关的研究结果显示了未来放疗增敏的发展潜力。分子靶向药物是近来肿瘤内科治疗领域的重大进展之一。并在一些肿瘤的治疗中取得重大的突破。但分子靶向药物与放疗的联合应用,目前相关的研究报道不多。随着对放射敏感基因的进一步研究和认识,分子靶点以及细胞信号通路与放射敏感性的关系也受到了较多的关注。有报道认为细胞的PI3K/Akt信号传导路径在细胞放射敏感性的作用有非常重要的意义。而RAS/RAF/ERK信号通路与肿瘤细胞放射敏感性的关系则是近来受到关注的另一条通路。近期的研究发现阻断RAF-1或其介导的信号通路中其他信号分子位点,可以显著提高部分辐射抵抗肿瘤的辐射敏感性。对于分子靶向药物辐射增敏作用机制的认识,有报道认为分子靶向药物辐射增敏作用的理论基础与下列的机制相关:①抑制肿瘤细胞增殖和放射损伤的修复。肿瘤细胞受到辐射损伤后启动的损伤修复机制与细胞信号传导通路中的许多关键靶分子相关,分子靶向药可以通过对这些靶分子活性抑制而辐射增敏作用。②使肿瘤细胞周期再分布。③细胞毒作用或诱导凋亡作用。许多分子靶向药物都具有直接或间接诱导细胞凋亡作用使致克隆细胞数目减少,与放射联合将发挥空间协同作用,从而提高放射的敏感性。④抑制肿瘤血管生成。主要针对内皮细胞生长因子VEGF起作用。甲苯磺酸索拉非尼片中文名又叫多吉美,是一种新型多靶点抗肿瘤药物,是多激酶抑制剂（multi-kinase inhibitor）,其抗肿瘤作用机制为,一方面通过抑制RAF/MEK/ERK信号传导通路直接抑制肿瘤生长:另一方面通过抑制VEGF和血小板衍生生长因子（PDGF）受体而阻断肿瘤新生血管的形成,间接地抑制肿瘤细胞的生长。目前索拉非尼用于肝癌治疗的3期临床试验已经于2006年底完成。除肝癌与肾癌外,最近国内的一些研究还进行了索拉非尼对肺肿瘤、前列腺癌、恶性黑色素瘤以及乳腺癌的治疗作用的探索。国外的文献中有关索拉非尼联合化疗对肾癌、结肠癌的治疗已有一些报道,但索拉非尼联合放疗对肝癌细胞作用的有关研究国内外目前均还未见报道。因此设想用实验的方法观察索拉非尼对体外培养的肝癌细胞株HepG2的辐射增敏效应。方法:1、用MTT实验观察药物对细胞的生长抑制及杀伤作用,了解药物不同浓度和作用时间对细胞的抑制作用程度,IC50值,并初步观察药物的不同浓度作用下的细胞存活曲线。2、细胞克隆形成率实验通过选择合适的药物浓度与不同放疗剂量的联合作用于细胞后观察细胞的克隆形成集落数量来观察细胞的存活曲线,通过曲线的相关参数以及放射增敏比的比较来观察药物对肝癌细胞株HepG2的辐射增敏作用。3、用PI染色法通过FCM检测实验处理后的细胞周期分布变化;用AnnexinV-FITC标记染色及PI染色的双染方法并通过FCM检测分析实验处理后的细胞凋亡率。初步探讨索拉非尼对肝癌细胞株HepG2辐射增敏作用的相关机制。结果:1、MTT实验的结果显示索拉非尼单独使用时对HepG2细胞的具有抑制作用,抑制作用程度与药物浓度有关,还与作用时间有关,其作用3天、4天的IC50值分别为11.5ug/ml和8ug/ml。从细胞存活曲线实验结果的看,其对细胞抑制作用的程度,是随着药物的浓度增加而增强,大致呈线性关系。从作用时间看,作用时间延长抑制作用的强度也加大。2、细胞克隆形成率实验结果:用9ug/ml Sorafenib对照射后HepG2细胞存活分数（SF）按线型二次模型拟合曲线,为向左下略带弧度的曲线。对两条曲线的参数（α、β、α/β）进行比较（均P<0.05）显示出了统计学意义。对存活分数SF2比较,单纯照射组为0.5125±0.0106,索拉非尼+照射组为0.4607±0.0094,经两样本均数的比较,P=0.003（t=6.34,n=3）具有统计学差异;对2.0Gy照射剂量水平的辐射增敏比的比较,索拉非尼药物+照射组的SER为:1.3478±0.0758,与单纯照射组的SER（1.1753±0.0055）比较,P=0.017（t=-3.928,n=3）,具有统计学意义。统计学分析的实验数据表明,索拉非尼对肝癌细胞株HepG2具有的辐射增敏作用。3、HepG2细胞经加或不加索拉非尼进行6.0Gy照射处理后,细胞周期分布结果显示索拉非尼具有去周期阻滞的作用,加用索拉非尼后细胞被阻滞在G2/M期的比率与单纯照射组比较明显下降。细胞凋亡实验则显示,加用索拉非尼的照射组的凋亡率为:14.45±2.72比单纯药物（凋亡率为:10.37±2.28）或单纯照射组(凋亡率10.06±1.30的凋亡率明显增加,方差分析（均P=0.008）显示具有统计学意义。结论:1、MTT实验结果表明,索拉非尼单独作用于肝癌细胞株HepG2具有对细胞生长抑制作用,其抑制的程度与药物作用浓度有关系,随药物浓度的增加,抑制作用增强。还与药物的持续作用时间有关系,在2-5天的作用时间内,随药物的作用时间延长,对细胞的抑制作用也相应增加。药物对细胞的抑制作用与药物的浓度类似线性关系。2、克隆形成率实验的结果表明,索拉非尼对肝癌细胞株HepG2具有辐射增敏作用。结合MTT实验的结果,其增敏作用模式,认为是以1+1>2模式进行叠加和增强而发挥作用。3、细胞周期分布实验和细胞凋亡实验经FCM分析发现索拉非尼对辐射后的细胞具有去周期阻滞效应同时细胞的凋亡率也相应增加。结合索拉非尼的药理作用机制分析,其对肝癌细胞株HepG2的辐射增敏机制与其对辐射后的细胞去周期阻滞和抑制辐射损伤后修复,增加细胞凋亡率有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 研究的背景和目的
• 实验设想
• 实验设计方案实验器材
• 实验一:MTT实验
• 实验二:克隆集落形成率实验
• 实验三:FCM检测细胞凋亡及细胞周期分布
• 全文小结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 文中缩略词
• 统计学证明
• 致谢