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紫萍总黄酮提取、纯化工艺及其抗癌、抗氧化损伤的活性研究

2020-11-22阅读(621)

紫萍总黄酮提取、纯化工艺及其抗癌、抗氧化损伤的活性研究

论文摘要

紫萍在我国分布广泛，其全草是《中华人民共和国药典》收录的常用中药材品种之一，具有利尿、发汗、清热、解毒的功效；有少量文献报道，紫萍也具有防癌、抗癌的功效，但国内外未见对紫萍中抗癌活性部位及其抗癌机理的相关报道。论文以此为切入点，重点研究了紫萍中抗癌活性部位的制备工艺及其抗癌机理，这对紫萍的活性成分及药理药效等方面，具有重要的学术研究价值，同时对紫萍的利用和开发具有重要的指导作用。此外，论文自主设计、开发了定量分析薄层色谱图像的MATLAB程序，这将为中药现代化中的质量评价方法提供一种新的借鉴和参考。论文的主要内容和结果如下： ①以人肝癌细胞株SMMC-7721为试验材料，利用MTT比色法测定药物作用后细胞的存活率，确定紫萍中具有抗癌活性的有效部位。结果表明，紫萍的抗癌活性主要来自于其中所含的黄酮类化合物。各试验样品中黄酮含量越高，则该样品对癌细胞的抑制率也就越大。 ②对从紫萍中提取、纯化总黄酮的工艺条件进行了优化。（1）在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验确定了乙醇溶液提取总黄酮的最佳工艺参数：乙醇浓度60％，提取温度60℃，料液比为1∶10，提取时间2h，进行2次提取。（2）确定了壳聚糖絮凝除杂的最佳工艺条件为：壳聚糖粘度为30Pa·s，加入量为6％，絮凝温度为60℃，絮凝时溶液的pH值为5.5。（3）探讨了大孔吸附树脂法纯化紫萍总黄酮的工艺。研究结果表明，AB-8型大孔吸附树脂适合于紫萍总黄酮的纯化，纯化工艺条件为：上柱样品pH值为5-6，以1BV／h的速度流过树脂，待吸附平衡后，用4BV的蒸馏水以2BV／h的速度淋洗树脂，然后用70％的乙醇溶液以1BV／h的流速进行洗脱，收集第2-3BV时的洗脱液，其干燥品中的黄酮纯度可达80％左右。 ③论文以MATLAB软件为开发平台，自行编写程序，对薄层色谱图像中的各个展开点的物质含量进行了定量分析，并结合分光光度法和薄层色谱法，建立了一套多学科交叉的，简便、快速、准确、低成本的评价药物质量稳定性的方法。图像分析程序的可行性试验结果证明，该程序的分析结果与实际结果误差不超过3％，具有实用价值，可用于薄层色谱图像的定量分析。然后，利用论文中建立的质量稳定性的检测方法，以黄酮类化合物为研究对象，对相同工艺条件下制备得到的两批紫萍总黄酮的质量稳定性进行了研究，结果表明两批样品中总黄酮的含量和组成是稳定的，说明制备工艺具有良好的重现性。 ④以人肝癌细胞株SMMC-7721和人正常肝细胞株HL-7702为试验材料，研

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 1 绪论
  • 1.1 引言
  • 1.2 紫萍的研究现状
  • 1.2.1 紫萍的化学成分研究
  • 1.2.2 紫萍的药用研究现状
  • 1.3 黄酮类化合物简介及其研究进展
  • 1.3.1 黄酮类化合物提取工艺现状
  • 1.3.2 黄酮类化合物的测定
  • 1.3.3 黄酮类化合物的分离与纯化
  • 1.3.4 黄酮类化合物的药理活性
  • 1.4 论文的立项依据
  • 1.5 论文的研究内容与技术路线
  • 1.5.1 紫萍中抗癌有效部位的确定
  • 1.5.2 提取工艺优化
  • 1.5.3 纯化工艺研究
  • 1.5.4 产品制备工艺重现性的评价
  • 1.5.5 生物活性研究
  • 1.6 论文的创新性
  • 2 紫萍中抗癌有效部位的确定
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料、仪器与试剂
  • 2.2.1 试验材料
  • 2.2.2 试验试剂及配制
  • 2.2.3 试验仪器
  • 2.3 试验方法
  • 2.3.1 紫萍提取物制备
  • 2.3.2 大孔吸附树脂分离
  • 2.3.3 紫萍提取物中黄酮类化合物的测定
  • 2.3.4 细胞培养
  • 2.3.5 细胞抑制率的测定
  • 2.3.6 数据分析
  • 2.4 试验结果与分析
  • 2.4.1 紫萍醇提物及各萃取部分的抗癌活性
  • 2.4.2 具有抗癌活性部分黄酮含量的测定
  • 2.4.3 大孔吸附树脂分离得到的各部分的抗癌活性与黄酮含量
  • 2.5 讨论
  • 3 紫萍中总黄酮提取工艺的研究
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料、仪器与试剂
  • 3.2.1 试验材料
  • 3.2.2 试验仪器
  • 3.2.3 试验试剂
  • 3.3 试验方法
  • 3.3.1 提取工艺流程图
  • 3.3.2 提取过程
  • 3.3.3 标准曲线的制作
  • 3.3.4 紫萍中总黄酮含量的测定
  • 3.4 试验结果与分析
  • 3.4.1 标准曲线
  • 3.4.2 乙醇浓度对提取效果的影响
  • 3.4.3 提取温度对提取效果的影响
  • 3.4.4 料液比对提取效果的影响
  • 3.4.5 提取时间对提取效果的影响
  • 3.4.6 正交试验设计
  • 3.4.7 最佳工艺的验证
  • 3.5 讨论
  • 4 絮凝条件的研究
  • 4.1 引言
  • 4.2 试验材料与药品
  • 4.2.1 试验材料
  • 4.2.2 试验设备
  • 4.2.3 试验试剂与配制
  • 4.3 试验方法
  • 4.3.1 絮凝方法
  • 4.3.2 蛋白质含量测定
  • 4.3.3 透光率的测定
  • 4.3.4 黄酮含量的测定
  • 4.4 试验结果与分析
  • 4.4.1 壳聚糖加入量对絮凝效果的影响
  • 4.4.2 絮凝温度对絮凝效果的影响
  • 4.4.3 粗提液的pH值对絮凝效果的影响
  • 4.4.4 壳聚糖的粘度对絮凝效果的影响
  • 4.5 讨论
  • 5 大孔吸附树脂分离紫萍总黄酮的研究
  • 5.1 引言
  • 5.2 试验材料、仪器与试剂
  • 5.2.1 试验材料
  • 5.2.2 试验仪器
  • 5.2.3 试验试剂
  • 5.3 试验方法
  • 5.3.1 大孔吸附树脂的预处理
  • 5.3.2 吸附树脂的装柱
  • 5.3.3 大孔树脂对紫萍总黄酮吸附量的测定
  • 5.3.4 紫萍总黄酮解吸率的测定
  • 5.3.5 大孔树脂对紫萍总黄酮的动态吸附试验
  • 5.3.6 解吸试验
  • 5.3.7 黄酮含量的检测
  • 5.4 试验结果
  • 5.4.1 三种树脂对紫萍总黄酮的吸附与解吸试验
  • 5.4.2 AB-8对紫萍总黄酮纯化条件的研究
  • 5.5 讨论
  • 6 紫萍总黄酮制备工艺重现性的评价
  • 6.1 引言
  • 6.2 试验材料、仪器与试剂
  • 6.2.1 试验材料
  • 6.2.2 试验仪器
  • 6.2.3 试验试剂
  • 6.3 试验方法
  • 6.3.1 紫萍提取物的制备
  • 6.3.2 分光光度法测定紫萍提取物中总黄酮含量
  • 6.3.3 紫萍提取物的薄层层析
  • 6.3.4 MATLAB图像分析
  • 6.3.5 数据处理
  • 6.4 试验结果与分析
  • 6.4.1 分光光度法评价紫萍提取物的稳定性
  • 6.4.2 MATLAB对薄层层析色谱分析的可行性分析
  • 6.4.3 紫萍提取物的薄层色谱与图像分析
  • 6.5 讨论
  • 7 紫萍总黄酮对肝癌细胞SMMC-7721的影响
  • 7.1 引言
  • 7.2 试验材料、仪器与试剂
  • 7.2.1 试验材料
  • 7.2.2 试验试剂与配制
  • 7.2.3 试验仪器
  • 7.3 试验方法
  • 7.3.1 SMMC-7721细胞和HL-7702细胞的培养
  • 7.3.2 四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法
  • 7.3.3 SMMC-7721细胞和HL-7702细胞生长曲线的测定
  • 7.3.4 STF对SMMC-7721细胞和HL-7702细胞增殖影响的测定
  • 7.3.5 STF对SMMC-7721细胞内总蛋白含量的影响
  • 7.3.6 STF对SMMC-7721细胞SDH、LDH和γ-GT活性的影响
  • 7.3.7 STF对SMMC-7721细胞ALP活性的影响
  • 7.3.8 细胞周期检测
  • 7.3.9 细胞凋亡检测
  • 7.3.10 Bcl-2与p53蛋白检测
  • 7.3.11 数据分析
  • 7.4 试验结果与分析
  • 7.4.1 人肝癌细胞SMMC-7721的生长曲线
  • 7.4.2 人正常肝细胞HL-7702的生长曲线
  • 7.4.3 STF对SMMC-7721和HL-7702细胞增殖的影响
  • 7.4.4 STF对SMMC-7721细胞内SDH和LDH活性的影响
  • 7.4.5 STF对SMMC-7721细胞内总蛋白含量的影响
  • 7.4.6 STF对SMMC-7721细胞内ALP活性的影响
  • 7.4.7 STF对SMMC-7721细胞内γ-GT活性的影响
  • 7.4.9 STF对SMMC-7721细胞形态和细胞周期的影响
  • 7.4.10 STF诱导SMMC-7721凋亡的情况
  • 7.4.11 STF对bcl-2和p53蛋白水平的影响
  • 7.5 讨论
  • 8 紫萍总黄酮对H2O2诱导的内皮细胞氧化损伤的保护作用
  • 8.1 引言
  • 8.2 试验材料、试剂与仪器
  • 8.2.1 试验材料
  • 8.2.2 试验试剂与配制
  • 8.2.3 试验仪器
  • 8.3 试验方法
  • 8.3.1 ECV-304的培养
  • 8.3.2 四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法
  • 8.3.3 ECV-304细胞生长曲线的测定
  • 8.3.4 STF对ECV-304细胞的影响
  • 8.3.5 H2O2对内皮细胞损伤试验
  • 8.3.6 STF对H2O2损伤内皮细胞的保护作用
  • 8.3.7 ECV-304细胞中MDA含量测定
  • 8.3.8 T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT、NO测定
  • 8.3.9 数据处理
  • 8.4 试验结果
  • 8.4.1 EVC-304细胞生长曲线
  • 8.4.2 STF对EVC-304细胞的影响
  • 8.4.3 H2O2细胞损伤试验
  • 8.4.4 STF对ECV-304细胞氧化损伤保护作用
  • 8.4.5 STF对ECV-304中MDA的影响
  • 8.4.6 STF对ECV-304细胞T-AOC的影响
  • 8.4.7 STF对ECV-304细胞内SOD、CAT和GSH-Px活力的影响
  • 8.4.8 STF对ECV-304细胞内NO含量的影响
  • 8.5 讨论
  • 9 全文结论与后续工作建议
  • 9.1 全文的主要结论
  • 9.1.1 紫萍中具有抗癌活性的有效部位的确定
  • 9.1.2 紫萍总黄酮制备工艺的优化与稳定性研究
  • 9.1.3 紫萍总黄酮的抗癌和抗氧化损伤活性研究
  • 9.2 后续工作建议
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录
  • 独创性声明
  • 学位论文版权使用授权书

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