水稻中一个SUSIBA2相似基因的功能研究

论文摘要

禾谷类作物的胚乳具有重要的经济价值。淀粉是谷类作物胚乳中最主要的贮存碳源,它由直链淀粉和支链淀粉混合而成的,两者在胚乳中的比例决定了禾谷类作物谷粒的质量。胚乳中淀粉的生物合成主要由腺嘌呤-葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）、淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（SBE）和脱分支酶（DBE）这4种酶参与完成的,其中后两者在支链淀粉的形成过程中起重要作用。大麦糖信号因子SUSIBA2是一个WRKY家族的转录因子,它能够识别大麦的一种淀粉脱分支酶基因——异淀粉酶基因isol和一种淀粉分支酶基因sbeIIb的启动子区域上的糖响应元件SURE,激活isol基因和sbeIIb基因的表达,从而影响胚乳中淀粉的积累状况。为了了解水稻中是否存在与大麦相似的淀粉合成调控机制,本论文进行了四个方面的研究:1)构建了由ubi启动子驱动的SUSIBA2基因的正反义表达载体,通过农杆菌介导对水稻进行了转化。用PCR对再生苗的潮霉素基因（hpt）、目的基因SUSIBA2、启动子ubi等均进行检测,共证实获得4株转入正义表达的SUSIBA2基因的T0代植株。2)根据SUSIBA2的序列,从水稻基因组序列中搜索到一个与其相似的WRKY基因,它由6个外显子和5个内含子组成。利用PCR方法从水稻基因组DNA中克隆出该基因的第3外显子的片段,长度为455bp,它包含1个WRKY保守结构域。以此作为干扰序列,构建了RNA干扰载体,并对水稻进行了遗传转化。对再生苗潮霉素基因（hpt）的PCR检测,共获得16株T0代阳性植株,转化率为8%。于田间种植至结实,有2株结实率为0,有11株转基因植株的结实率为0.5%-28%之间,表明T0转基因植株结实状况极不正常。将收获的正常种子继续播种至出苗,再进行PCR检测,发现有6株在其T1代单株间出现约3∶1的hpt基因分离比。3)在非编码区设计引物,采用RT-PCR技术,从水稻幼穗中克隆到该基因的cDNA,长度为1921bp,其中ORF长1755bp,可编码584个氨基酸。其蛋白序列具有典型的双WRKY结构域,与大麦的SUSIBA2相似度达81%。我们将该基因命名为SUSIRI。Southern分析表明,SUSIRI在水稻基因组中只有一个拷贝。Northern blot分析结果显示,该基因在稻穗中的表达活性在水稻抽穗至种子成熟的发育过程中逐渐减弱。这与SUSIBA2基因在大麦胚乳中的表达模式有着明显的不同。4)已证实水稻淀粉分支酶sbe1基因是在胚乳中特异表达的。本研究从水稻基因组中克隆了长度为849bp的sbe1基因的启动子区域片段。利用植物cis调控元件数据库PLACE对克隆到的sbe1启动子序列进行了分析,共发现存在有77种可能的调控元件,包含有W-box。但未发现其上存在糖信号应答元件SURE。将克隆的sbe1启动子与前面克隆的SUSIRI基因融合,构建成由胚乳特异启动子驱动的SUSIRI正义与反义表达载体。同时,将SUSIRI基因与Ubi启动子融合,构建成组成型的SUSIRI正义表达载体。为进一步通过转基因手段验证该基因的作用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 文献综述
• 1 禾谷类作物（水稻）胚乳中淀粉的合成及其调控的研究
• 1.1 谷类作物胚乳中的淀粉合成酶
• 1.1.1 ADP葡萄糖合成酶（ADP-Glucose synthase,AGP）
• 1.1.2 淀粉合成酶（starch sythase,SS）
• 1.1.3 淀粉分支酶（starch branching enzyme,SBE or BE）
• 1.1.4 淀粉脱分支酶（starch debranching enzyme,DBE）
• 1.2 谷类作物胚乳中淀粉合成的调控
• 1.2.1 糖对库源器官中碳水化合物质分配的调控
• 1.2.2 转录水平的调控
• 1.2.3 蛋白水平的调控
• 2 大麦WRKY转录因子SUSIBA2对淀粉合成的调控机制
• 3 水稻中WRKY家族转录因子研究状况
• 第一章 大麦SUSIBA2基因对水稻的遗传转化
• 1.1 引言
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 实验材料
• 1.2.2 主要试剂及酶
• 1.2.3 用于PCR扩增的引物
• 1.2.4 培养基
• 1.2.5 实验方法
• 1.2.5.1 载体构建
• 1.2.5.2 重组载体对根癌农杆菌的转化
• 1.2.5.3 农杆菌介导的水稻转化
• 1.2.5.4 转基因水稻的PCR分子检测
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 表达载体的构建流程
• 1.3.2 表达载体的鉴定
• 1.3.2.1 重组质粒的PCR鉴定
• 1.3.2.2 重组质粒的酶切鉴定
• 1.3.3 SUSIBA2基因对水稻的转化及PCR鉴定
• 1.3.3.1 转基因水稻中hpf基因的检测
• 1.3.3.2 转基因水稻中目的基因SUSIBA2的检测
• 1.3.3.3 转基因水稻中Ubi启动子的检测
• 1.3.3.4 转基因水稻中Ubi启动子与正向SUSIBA2之间的相连区域的检测
• 1.4 讨论
• 第二章 水稻中SUSIBA2相似基因的RNA干扰体系的建立
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 干扰片断的克隆
• 2.2.2.2 干扰载体的构建
• 2.2.2.3 转化水稻
• 2.2.2.4 转基因水稻PCR检测
• 0代转基因水稻性状的初步调查'>2.2.2.5 T₀代转基因水稻性状的初步调查
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 水稻SUSIBA2相似基因组中第三个外显子的克隆
• 2.3.2 水稻SUSIBA2相似基因干扰载体的构建与酶切检测
• 2.3.3 SUSIBA2相似基因RNAi载体对水稻的转化及转基因苗的初步检测
• 2.4 讨论
• 第三章 水稻中SUSIBA2相似基因的克隆与表达分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 植物材料和有关试剂
• 3.2.2 克隆水稻SUSIBA2相似基因的引物序列的设计
• 3.2.3 水稻SUSIBA2相似基因的克隆
• 3.2.3.1 水稻稻穗中RNA的提取
• 3.2.3.2 RT-PCR扩增cDNA
• 3.2.4 水稻SUSIBA2相似基因的southern印迹分析
• 3.2.4.1 探针的标记
• 3.2.4.2 水稻DNA提取
• 3.2.4.3 酶切及电泳
• 3.2.4.4 转膜
• 3.2.4.5 杂交及检测
• 3.2.5 水稻SUSIBA2相似基因的Northern分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 水稻稻穗RNA的提取结果
• 3.3.2 水稻SUSIBA2相似基因的RT-PCR结果
• 3.3.3 水稻SUSIBA2相似基因的cDNA序列
• 3.3.4 水稻SUSIBA2相似基因的Southern分析
• 3.3.5 水稻SUSIBA2相似基因的表达模式
• 3.4 讨论
• 第四章 水稻中SUSIBA2相似基因的过表达载体的构建
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 主要试剂及酶
• 4.2.3 用于PCR扩增的引物
• 4.2.4 实验方法
• 4.2.4.1 水稻DNA提取
• 4.2.4.2 PCR反应扩增水稻sbe1启动子
• 4.2.4.3 表达载体的构建
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 水稻sbe1基因启动子的克隆
• 4.3.2 水稻sbe1启动子驱动的SUSIRI正义与反义真核表达载体的构建
• 4.3.2.1 构建流程
• 4.3.2.2 sbe1启动子与gus基因重组质粒的PCR筛选及酶切鉴定
• 4.3.2.3 sbe1启动子与SUSIRI基因重组质粒克隆的PCR筛选及SUSIRI基因插入方向的酶切鉴定
• 4.3.3 Ubi驱动的SUSIRI正义表达载体的构建
• 4.4 讨论
• 第五章 结论与展望
• 参考文献
• 附录:攻读博士学位期间发表和撰写的主要论文
• 致谢