莲藕多酚氧化酶的纯化及环境因素对其溶液构象的影响

论文摘要

采用磷酸缓冲液为提取溶剂从莲藕中提取莲藕多酚氧化酶（PPO）,通过考察提取方式、提取缓冲液保护剂、提取时间及料液比等因素对酶活性及酶量的影响确定了莲藕PPO的最佳提取方法;采用硫酸铵分级沉淀结合Sephadex DEAE A-50及Sephadex G-75柱层析等纯化步骤实现了莲藕PPO的分离纯化,并通过SDS-PAGE电泳进行了纯度鉴定和分子量测定。研究了莲藕PPO的酶学性质,用氨基酸自动分析仪测定了其氨基酸组成,并采用圆二色谱（CD）、荧光光谱（FP）及傅立叶红外光谱（FT-IR）研究了莲藕PPO的溶液构象。重点研究了溶液微环境效应（包括温度和pH值）对莲藕PPO溶液构象的影响,莲藕PPO与外源性底物、自身底物相互作用以及莲藕PPO与抑制剂相互作用的光谱学分析。主要研究结果如下:1.莲藕PPO的提取条件及纯化方法新鲜藕肉去皮打浆后,采用pH值为5.4的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液（含5%PVPP和10%NaCl）提取,料液比为1:2.2,置4℃冰箱中浸提4h,提取的莲藕PPO活性最大。提取液经30%饱和度的硫酸铵除杂,经80%饱和度的硫酸铵粉沉淀后,经溶解、透析、除盐后,经DEAE Sephadex A-50及Sephadex G-75凝胶柱,收集PPO活性峰,透析除盐后经SDS-PAGE电泳,呈单一染色带。2.莲藕多酚氧化酶的酶学性质、分子量及结构表征莲藕PPO以邻苯三酚为最适底物,其最适pH为7.0,最适温度为50℃,Km值为11mmol/L。经SDS-PAGE电泳,比较标准蛋白分子量,得出莲藕PPO的分子量约为21kD。将莲藕PPO进行氨基酸组成分析,根据各氨基酸相对含量和酶的分子量可推算出莲藕PPO中的氨基酸总和约164个。其中非极性氨基酸残基（Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Met,Phe,Trp）为39.62%,极性氨基酸（Gly,Ser,Thr,Cys,Tyr,Asp,Glu,Lys,Arg,His）为57.92%,酸性氨基酸（Asp,Glu）为18.32%,碱性氨基酸（Lys,Arg,His）为10.39%。采用圆二色谱、荧光光谱及红外光谱研究了莲藕PPO的构象,结果表明,浓度为0.3mg/ml的莲藕PPO,其圆二色谱显示在209nm和222nm处有双负峰,分子中α-螺旋构象和β-折叠构象分别占43%和57%。荧光光谱显示最大荧光强度在329nm处,荧光强度为370。结合氨基酸组成分析,荧光光谱表明Trp残基和Tyr残基同时被激发后,发生了从Tyr残基到Trp残基之间的能量转移。红外吸收中有明显的酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带,分别位于1658cm-1和1544cm-1处,酰胺Ⅲ带在1240 cm-1处有归属于α-螺旋构象的吸收峰。3.微环境效应对莲藕多酚氧化酶溶液构象的影响不同pH值下莲藕PPO的二级结构变化:莲藕PPO在中性pH环境中活性最高,圆二色谱显示在209nm和222nm处有双负峰,分子中α-螺旋构象和β-折叠构象分别占43%和57%。荧光光谱显示最大荧光强度在329nm处,荧光强度为370。随着pH值的升高或降低,莲藕PPO的活性和二级结构都发生显著变化,在pH＜5和pH＞10的条件下,其活性显著降低,分子中α-螺旋构象显著降低,同时β-折叠和无规则卷曲构象明显增加;荧光λmax发生红移;荧光强度随着pH值的升高而增强。pH值通过微扰莲藕PPO的二级结构而影响其活性,莲藕PPO的活性中心可能位于α-螺旋结构中,莲藕PPO中α-螺旋构象和β-折叠构象的合理配置可能是保持其活性的适宜构象。不同温度下莲藕PPO的二级结构变化:随着温度的升高,莲藕PPO活性上升,当温度升高至60℃并保温数分钟后,发生了热变性,活性开始下降,其二级结构中,其α-螺旋构象从42.4%降至0.8%,β-折叠构象从56.7%上升至83%,无规则卷曲含量上升至16.2%。其荧光强度随着温度的升高而下降,最大发射波长蓝移了3nm。红外光谱中各酰胺带均发生不同程度的位移,且其红外吸收减小,酰胺Ⅲ带中1240 cm-1处归属于α-螺旋构象的吸收峰移至1245 cm-1。综上可推知,莲藕PPO的热变性温度为60℃。4.莲藕PPO与底物之间的相互作用活性实验结果表明,以邻苯三酚做底物,莲藕PPO活性最高。圆二色谱结果表明,莲藕PPO与邻苯三酚、邻苯二酚、没食子酸作用后,其α-螺旋构象均显著降低,β-折叠构象升高,无规则卷曲含量上升至16.5%左右。邻苯三酚与PPO相互作用后,其荧光强度下降,峰位不变。邻苯二酚与PPO相互作用后,其荧光强度显著上升,没食子酸与PPO作用后,Trp残基红移最显著,可能是Trp过度地暴露所致。从溶液构象的变化可知,Trp残基的过度暴露不利于莲藕PPO维持活性构象。应用圆二色谱、荧光光谱研究莲藕自身底物与莲藕PPO相互作用的二级结构变化。结果表明,莲藕PPO的二级结构中出现了10.3%的β-转角,其α-螺旋构象从37.1%降为12.3%,β-折叠构象从62.9%下降至58.5%,无规则卷曲含量上升至18.9%。荧光光谱中,Trp残基的荧光强度增加,最大发射波长红移至348nm,可知Trp残基暴露于部分疏水环境所致,可推知β-转角结构为PPO进行催化反应的重要的中间构象,Trp暴露于部分疏水环境有利于维持PPO催化活性构象。5.莲藕PPO与抑制剂之间相互作用的研究测定了莲藕PPO在不同酶活抑制剂作用下的酶活性变化情况。比较了几种常用酶活抑制剂抑制剂A、氯化钙、半胱氨酸、柠檬酸、EDTA-2Na等对莲藕PPO活性的抑制效应。结果表明:抑制剂A、半胱氨酸及氯化钙对莲藕PPO活性的抑制效果较强,抑制率分别为96.2%,86.8%及82.4%。柠檬酸及EDTA抑制效果较低。圆二色谱结果表明,抑制剂A严重破坏了莲藕PPO二级结构中的α-螺旋,其α-螺旋构象含量降为0。氯化钙、半胱氨酸、柠檬酸及EDTA也破坏了莲藕PPO二级结构中的α-螺旋,但α-螺旋构象仍有残留。加入抑制剂后,莲藕PPO二级结构中的β-折叠构象含量及无规则卷曲含量普遍升高。荧光光谱结果表明,氯化钙、半胱氨酸、柠檬酸及EDTA与莲藕PPO结合后,其荧光发射光谱峰位及峰型变化较相似,当加入抑制剂A后,其发射峰型发生显著变化,红移最显著,说明其Trp残基在亲水的环境中暴露程度最大。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 前言
• 1 莲藕褐变研究进展
• 1.1 莲藕多酚类化合物的研究进展
• 1.2 莲藕褐变控制研究进展
• 1.3 莲藕多酚氧化酶的研究进展
• 2 蛋白质溶液构象的研究进展
• 2.1 蛋白质的结构理论
• 2.2 研究蛋白质溶液构象的方法
• 3 研究目的、意义及内容
• 第二章 莲藕多酚氧化酶的分离纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料和仪器设备
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 莲藕多酚氧化酶的酶活测定方法的比较
• 2.2 莲藕多酚氧化酶提取方法的比较
• 2.3 莲藕多酚氧化酶提取条件的优化
• 2.4 粗酶液的硫酸铵分级沉淀分析结果
• 2.5 莲藕多酚氧化酶的柱层析纯化
• 2.6 莲藕多酚氧化酶纯度的SDS-PAGE鉴定结果
• 3 讨论
• 第三章 莲藕多酚氧化酶的酶学性质及结构表征
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料和仪器设备
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 莲藕多酚氧化酶酶学特性的分析
• 2.2 莲藕多酚氧化酶的分子量
• 2.3 莲藕多酚氧化酶的结构表征
• 3 讨论
• 第四章 微环境效应对莲藕多酚氧化酶溶液构象的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料和仪器设备
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 环境pH值对酶溶液构象的影响
• 2.2 环境温度对酶溶液构象的影响
• 3 讨论
• 3.1 环境pH值对PPO溶液构象的影响
• 3.2 环境温度对PPO溶液构象的影响
• 第五章 莲藕多酚氧化酶与底物及抑制剂相互作用的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料和仪器设备
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 莲藕多酚氧化酶与外源底物相互作用
• 2.2 莲藕多酚氧化酶与内源底物相互作用
• 2.3 莲藕多酚氧化酶与抑制剂相互作用
• 3 讨论
• 3.1 莲藕PPO底物之间的相互作用
• 3.2 莲藕PPO与抑制剂之间的相互作用
• 第六章 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢