霍乱毒素B亚单位基因在胡萝卜中的表达

论文摘要

霍乱是由霍乱弧菌引起的一种烈性肠道传染病,是世界七大流行病之一,为我国甲类法定传染病,具有发病急、传播快、波及面广等特点,危害极其严重。自1817年发现霍乱以来,已发生过7次世界性的大流行,因此其预防和控制受到各国政府的高度重视。预防霍乱发生的有效方式除了有赖于安全水源和提高卫生条件外,更为重要的是发展廉价实用的霍乱疫苗。现有疫苗费用昂贵,贮存、运输相当困难,因此,研制成本低、使用简单、易于贮存运输的新疫苗是疫苗研究的一大热点。植物基因工程技术的不断成熟为新型疫苗的研究提供了新的思路。转基因植物产生的疫苗,可由人体简单摄食含该种疫苗的植物组织,通过刺激机体黏膜的特异性免疫应答,使人体获得较持久的疾病防御能力。由于成本低廉、无需冷藏、无需一次性针头、使用方便,因此,“植物口服疫苗”得到了世界卫生组织(WHO)的提倡,开展这方面的研究对推动全球免疫计划的实施具有重要的意义。本研究利用植物DNA重组技术,以胡萝卜下胚轴为受体材料,采用农杆菌介导法将霍乱毒素B亚单位基因(CTB)导入到胡萝卜中,得到了转CTB基因的T0代植株110棵,通过穴盘播种T1代种子得到T1代植株172棵。分别用通用引物和特异引物,对获得的卡那霉素抗性植株进行了PCR检测筛选。110株T0代植株中引物n1/n2检测出90株为阳性,阳性率达到81.8%,p1/p2和c1/c2检测阳性率分别为72.7%和34.5%;相应的T1代植株n1/n2、p1/p2、c1/c2检出阳性率最高分别为88.6%,74.3%,31.4%,遗传稳定性较好。采用ELISA法对转基因植株中CTB表达水平进行了检测,结果表明导入的CTB基因在转基因胡萝卜中的整体表达水平不高,活性CTB含量最高为2.959μg/g·FW,但在部分转基因植株中不表达;在转基因植株中,CTB表达存在器官特异性,在叶片和块根中均有特异性的表达,且叶片表达量较块根高,而在茎中却不表达。进一步采用Western杂交对ELISA检测过的转基因胡萝卜的基因表达水平进行了分析,验证了转霍乱毒素B基因胡萝卜体内表达的CTB蛋白的存在,结果证实转基因胡萝卜中CTB可与抗体特异性结合,且复性后目的蛋白以五聚体的形式表达,这为进一步的动物试验研究打下了基础。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 英文缩略词
• Ⅰ 文献综述
• 1 转基因植物的研究进展
• 1.1 目的基因的分离鉴定
• 1.2 植物表达载体的构建
• 1.3 植物遗传转化方法
• 1.4 转基因植物的检测技术和方法
• 2 转基因植物口服疫苗的研究进展
• 2.1 植物成为口服疫苗的医学根据——黏膜免疫机制
• 2.2 转基因植物疫苗的优点
• 2.3 植物系统生产重组疫苗的途径
• 2.4 转基因疫苗的临床实验证据
• 2.5 用作植物疫苗的受体植物选择
• 2.6 转基因疫苗研究中存在的问题和解决方法
• 3 霍乱毒素B 亚基的研究进展
• 3.1 霍乱毒素B 亚基的分子结构
• 3.2 霍乱毒素B 亚单位的应用
• Ⅱ 的目的和意义
• Ⅲ 试验材料与方法
• 1 材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 植物材料
• 1.3 工具酶和试剂
• 1.4 引物设计及合成
• 1.5 仪器
• 1.6 试剂和培养基的配制
• 2 方法
• 2.1 胡萝卜无菌苗的获得
• 2.2 根癌农杆菌介导法对胡萝卜的遗传转化
• 2.3 抗性植株的生根及移栽
• 2.4 抗性植株的PCR 检测
• 1 代植株的获得及检测'>2.5 T₁代植株的获得及检测
• 2.6 植物蛋白抗原活性的EL15A 检测
• 2.7 转基因植株的Western 免疫印记分析
• Ⅳ 结果与分析
• 0和T₁ 卡那抗性植株的PCR 检测'>1 T₀和T₁ 卡那抗性植株的PCR 检测
• 2 转基因胡萝卜外源蛋白CTB 的ELISA 检测
• 3 转基因胡萝卜植株的Western 杂交
• Ⅴ 讨论
• 1 外源基因的检测
• 2 外源基因在转化植株中的遗传稳定性
• 3 转基因胡萝卜的表达
• Ⅵ 结论
• Ⅶ 参考文献
• 致谢
• 导师简介
• 个人简介