玉米胚乳突变体的诱导与鉴定

论文摘要

物理和化学诱变剂已经被证实可有效诱导出突变体、获得新的等位基因、增加基因多样性和丰富作物种质资源。但是,低诱变率和非常有限的目的突变在很大程度上限制了诱变育种的应用。使用诱变剂处理成熟种子就是一个例子。诱导突变是一个随机的过程,在导致表型变异的情况下筛选得到目的突变体更是难上加难。经过数十年的突变育种实践,现在已经发展出了很多使用不同物理和化学诱变剂处理活性器官或组织而不是成熟种子来提高诱变频率和扩展突变性状的手段。另一方面,植物分子遗传学和功能基因组学的最新进展促进了目的基因的筛选和鉴定。为了获得可行的伽马射线和叠氮钠的结合剂量用于突变诱导,我们使用不同剂量的60Co伽马射线和NaN3处理玉米愈伤组织,以其相对生长率[（恢复培养后的愈伤组织重-突变处理前的愈伤组织重）／突变处理前的愈伤组织重]来评价伽马射线和NaN3诱变处理对于愈伤组织生长的影响、筛选适宜处理玉米愈伤组织的伽马射线和NaN3结合剂量。结果证实,结合使用20 Gy的伽马射线和1 mmol/L的NaN3对于诱导玉米愈伤组织突变最为有效。我们在诱变后代中获得了三个表型为“超甜”的胚乳突变系,命名为sm-1、sm-2和sm-3。将已知基因型的四个甜玉米材料普甜susu、超甜sh2sh2、脆甜btIbt1、脆甜bt2bt2和这三个胚乳突变株系进行正反交,发现sm-1、sm-2、sm-3与超甜sh2sh2杂交果穗的籽粒严重皱缩、凹陷。该互补杂交结果说明sm-1、sm-2和sm-3极可能与超甜sh2sh2具有相同的基因型。而后通过DNA序列分析,发现三个突变株系突变位点位均于sh2基因的14号外显子中,该基因编码二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶是由两个SH2大亚基和两个BT2小亚基组成的异型四聚体,是玉米淀粉生物合成途径中的关键酶、限速酶。其某个亚基的失活或者两亚基间结合力的丧生都可导致AGPase的失活。根据其高度一致的农艺性状表型以及目前对sh2基因突变分子机制的了解,这三个突变系被认定为一个新的sh2基因突变体。互补杂交方法多用于微生物遗传学中鉴定是否在同一个基因中存在两个隐性突变（cistron）。但由于高等植物目前的研究水平、及大多数突变体无法找到合适的互补材料等限制,互补杂交无法在多数高等植物突变体检测试验中实现。但是,对于玉米胚乳突变,已经发现了较为丰富的胚乳突变体。这对于在分子检测前初步使用互补杂交的办法筛选可能的突变位点非常有帮助。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 日录
• 1. 文献综述
• 1.1 植物突变体的创造
• 1.1.1 自然突变
• 1.1.2 利用插入序列产生突变
• 1.1.3 物理或化学诱变剂诱发突变
• 1.1.4 空间诱变
• 1.2 植物突变体的检测分析方法
• 1.2.1 分子标记法
• 1.2.2 TAIL-PCR
• 1.2.3 表型鉴定
• 1.3 玉米淀粉合成途径的研究
• 1.3.1 从蔗糖到ADP葡萄糖
• 1.3.2 ADP葡萄糖进入质体
• 1.3.3 ADP葡萄糖合成直链淀粉
• 1.3.4 直链淀粉和支链淀粉之间的转化
• 1.4 甜玉米应用及其育种
• 1.4.1 甜玉米的特点及其发展现状
• 1.4.2 甜玉米选育手段和方式
• 1.4.3 甜玉米育种存在的问题
• 1.5 本研究的目的
• 2. 材料与方法
• 2.1 玉米愈伤组织的获得
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 愈伤组织获得
• 2.1.3 相关培养基配方
• 2.2 诱变处理
• 2.3 植株再生和突变体筛选
• 2.4 互补杂交测试
• 2.5 分子水平检测
• 2.5.1 菌种、引物及主要试剂来源
• 2.5.2 总DNA的提取
• 2.5.3 目的片段的PCR扩增
• 2.5.4 目的片段回收
• 2法制备大肠杆菌感受态细胞'>2.5.5 CaCl₂法制备大肠杆菌感受态细胞
• 2.5.6 目的片段连接到pTM19-T载体,转化大肠杆菌
• 2.5.7 序列拼接、比对
• 3. 结果与分析
• 3结合剂量'>3.1 适宜处理玉米愈伤组织的伽马射线和NaN₃结合剂量
• 3.2 胚乳突变体筛选和互补杂交测试
• 3.3 突变体分子水平检测结果
• 4. 讨论
• 3结合剂量'>4.1 适宜处理玉米愈伤组织的伽马射线和NaN₃结合剂量
• 4.2 新sh2突变体的发现
• 4.3 使用互补杂交方法鉴别玉米胚乳突变体的优势
• 5. 参考文献
• 致谢