论文题目: 白粉菌诱导下小麦早期反应基因的筛选及功能分析
论文类型: 博士论文
论文专业: 植物分子生物学
作者: 李爱丽
导师: 贾继增,王明理
关键词: 乳突,白粉菌,小麦,小麦脂质转运蛋白
文献来源: 中国农业科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 专性寄生真菌小麦白粉菌（Blumeria graminis f.sp. tritici, Bgt）引起的小麦白粉病是一种危害严重的世界性病害。在小麦（Triticum aestivum L．）中，针对白粉菌的小种专化抗性由Pm基因控制。本研究的目的是：1)在细胞学水平上揭示Pm基因介导的抗性反应特性；2)筛选白粉菌诱导下小麦早期反应基因并对其功能进行验证，以期初步解释Pm基因的作用机制。研究采用三个感性（百农3217，北京837和京双16）和五个抗性（Mardler[Pm2+Pm6]，Ulka／8*Cc[Pm2]，Mardler／7*百农3217[Pm2]，Pm16和Pm16／7*北京837[Pm16]）小麦品系，比较分析亲和及非亲和互作中接种后10到48小时（Hours after inoculation，hai）的过氧化氢（Hydrogen peroxide，H2O2）反应特性；并应用cDNA-AFLP技术筛选抗白粉病近等基因系Mardler／7*Bainong3217及其感病亲本Bainong3217经白粉菌诱导后早期反应基因；分析小麦脂质转运蛋白基因在不同倍性材料中的存在情况及不同胁迫条件对小麦脂质转运蛋白基因表达的影响；对候选早期表达基因及小麦脂质转运蛋白基因采用瞬时表达体系进行功能分析。研究结果如下：1、通过比较分析小麦与白粉菌亲和及非亲利互作过程中小麦叶片针对白粉菌BgtE09初生芽管（Primary germ tube，PGT）、附着胞芽管（Appressorial germ tube，AGT）、以及乳突和过敏反应（Hypersensitive response，HR）中H2O2的聚集情况，发现：1)在感性和抗性小麦品系的有效乳突以及邻近细胞质囊泡中均检测到了强H2O2聚集，表明作为对白粉菌的一般性防御，H2O2在有效乳突的形成中发挥着重要作用；2)在所有五个抗病品系中均检测到了高于感病品系的有效乳突频率；3)在抗性品系中，Mardler和Ulka／8*Cc高频率HR的出现早于Pm16和Pm16／7*北京837，但所有HR反应均表现为整个受攻击的表皮细胞充满H2O2；4) Pm2基因在近等基因系Mardler／7*Bainong3217中表现穿透抗性而非HR表明该基因在上述遗传背景中或许介导了一个非HR依赖的防御路径；5)在小麦与白粉菌非亲和互作中，HR作为限制病原菌侵染的第二道防线，当乳突反应不能有效阻止病原菌侵染时发挥作用。2、本研究利用cDNA-AFLP技术对白粉菌诱导下小麦叶片早期反应基因进行分析。实验共筛选AFLP引物组合（PstⅠ／MseⅠ）553对，获得差异片段283条。在测序的61条差异片段中，有26条与功能已知或未知的植物基因具有一定的序列相似性。选择其中6条和另外一条与细菌基因具有一定相似性的片段，应用基因特异引物进行半定量RT-PCR。结果有3条序列的表达模式得到了验证。我们分离了其中2条序列的完整编码区，它们分别是：小麦钙依赖性蛋白激酶2（TaCDPK2，acc. No.AY704444）和小麦氧化还原氧还蛋白1（TaPrxl，acc. No. AY789643）。TaCDPK2编码区1677bp（558个氨基酸），包含丝氨酸／苏氨酸激酶域（氨基酸：96-360）和钙调素类结构域（氨基酸：392-535，包括4个EF手性区）。接菌后3小时和6小时，TaCDPK2在抗性及感性材料中均呈现上调表达，表明TaCDPK2是一个一般性真菌防御基因，而不是抗性材料中针对白粉菌诱导特异表达的基因。TaCDPK2还表现为受盐和干旱胁迫诱导，表明该基因在小麦抗病、抗逆反应中普遍存在。TaCDPK2的表达不受低温胁迫诱导，且表现组织特异性。TaPrxl编码区654bp（217个氨基酸），包含一个AhpC-TSA13保守域（氨基酸：73-196）。接菌后，TaPrxl在抗性材料中呈现上凋表达的时间点早于感病材料（在取样时间范围内，约3小时）。TaPrxl瞬时过量表达的结果表明：与对照相比，过量表达TaPrxl使感病材料百农3217叶片上白粉菌的穿透率（Penetration efficient，PE）降低了25％。表明TaPrxl可能作为小麦白粉病抗性反应的一个早期调节子。TaPrxl的表达受低温／干旱／盐胁迫诱导，而且只在植物绿色组织中表达。另一个表达模式得到验证的差异片段为TDF A27，我们只获得了其相应的cDNA片段（608bp）。该608bp片段（flame=+3）假定氨基酸序列与水稻植物激素应答因子2（Auxin response factor 2，ARF2）的相似性为86％，并覆盖B3和auxin response两个保守域。经白粉菌诱导后，只在感病材料的1，3，6时间点检测到该片段所代表基因的转录本，而在感病材料其它处理时间点以及抗病材料所有取样时间点均未检测到其转录本，推测该基因可能与小麦感病性有关，这是首次关于植物激素路径与植物抗病防御反应路径有所交叉的报道。3、小麦LTP1基因参与了白粉病抗性反应：小麦LTP基因表达可被盐、干旱胁迫诱导并具有组织特异性；LTP1和LTP2在进化中比较保守；来自A基因组的LTP4是一个新发现的小麦LTP基因。
论文目录:
摘要
Abstract
文献综述
第一章 植物抗病(R)基因介导的抗病反应分子机制
1 植物抗病性的划分
1.1 非寄主抗性(non-host resistance)
1.2 非小种专化性抗性(race non-specific resistance)
1.3 小种专化性抗性(race specific resistance)
2 已经克隆并预测蛋白结构的植物R基因的类型及结构特点
3 R基因介导的植物抗病反应分子机制
3.1 R基因介导的植物—病原特异识别
3.2 R蛋白诱导的HR及早期局部信号传递网络
3.3 植物抗病反应中的系统信息作用网络
参考文献
第二章 控制大麦白粉病抗性的基因及其抗性分子机制研究进展
1 广谱(broad-spectrum)mlo抗性
1.1 mlo抗性表型
1.2 mlo突变体的多效性影响
1.3 mlo抗性所需的基因
1.4 Mlo蛋白家族
1.5 Mlo蛋白分子功能
1.6 大麦野生型Mlo基因的生物学功能
2 小种专化性抗性
2.1 小种专化性抗性表型
2.2 Mla locus的分子分析
2.3 Rar1基因为小种专化性抗性所必需
2.4 Sgt1基因为小种专化性抗性所必需
2.5 Rar1和sgt1在疾病抗性中的分子功能
参考文献
第三章 控制小麦抗白粉病抗性的基因及其抗性机制研究进展
第一节 小麦抗白粉病基因的来源、染色体定位及分子标记
1 Pm基因的来源
2 Pm基因染色体定
3 Pm基因的分子标记
第二节 小麦白粉病抗性机制研究进
1 小麦白粉菌致病的三个环节
2.1 局部抗性
2.1.1 乳突反应与穿透抗性
2.1.2 过敏反应与小种专化抗性
2.2 信号传递与系统抗性
2.2.1 质子泵(H~+-ATPase)
2.2.2 钙调素(CaM)
2.2.3 SA和JA
3 小麦白粉病抗性基因Pm3b的克隆及对其抗病机制的预测(对单个基因的研究)
4 小麦抗白粉病相关基因的研究(从基因群体水平上研究)
参考文献
研究结果
第一章 小麦与白粉菌亲和及非亲和互作早期H_2O_2反应的比较分析Comparative analysis of early H_2O_2 defense in compatible and incompatible wheat-powdery mildew interactions
Summary
Introduction
Materials and Methods
Plants, pathogens and inoculation
Histochemical detection of H_2O_2 at interaction sites
Results
H_2O_2 accumulation in response to PGT and AGT in wheat-powdery mildew compatible and incompatible interaction
H_2O_2 in incompatible interaction mediated by the Pm2+Pm6 genes
H_2O_2 in incompatible interaction mediated by the Pm16 gene
H_2O_2 in compatible interaction mediated by susceptible lines
Discussion
Acknowledgements
References
第二章 瞬时表达体系的构建
第一节 一个用于白粉病菌侵染大麦或小麦叶片早期反应基因功能分析的瞬时表达体系A transient expression system for the functional assessment of early response genes on the powdery mildew infected barley or wheat leaves
Abstract
1 The principle and the key steps of the transient assay system used in the interaction between barley or wheat and the powdery mildew
2 The development of the transient assay system and its application
3 The prospect of the transient assay system in the functional assessment of early response genes on the powdery mildew infected barley or wheat leaves
Acknowledgements
References
第二节 应用Helios~(TM)基因枪将外源基因导入小麦完整叶片Gene delivery into intact wheat leaves using the Helios~(TM) gene gun
Introduction
Materials and methods
Plant material
Plasmid DNA preparation
Coating of gold particles with DNA
Bullets
Shooting leaves
Gene expression
Observation
Results and discussion
Conclusion
References
第三章 白粉菌诱导下小麦早期反应基因的筛选及功能分析Identification and functional assessment of early response wheat genes induced by powdery mildew
Abstract
Introduction
Materials and methods
Plants, pathogens and inoculation
Chemical Induction and leaves harvested
cDNA-AFLP
Semi-quantitative RT-PCR analysis of transcripts
Generation of full length clones
Transient transformation assay
Results
Identification of wheat genes induced by powdery mildew fungus
Validation of expression patterns by semi-quantitative RT-PCR analysis
Isolation of a wheat cDNA encoding a CDPK
TaCDPK2 over expression
Differential expression of TaCDPK2 in different tissures and upon abiotic stress
Isolation of a wheat cDNA encoding a peroxinredoxin Q
TaPrx1 over expression
Differential expression of TaPrx1 in different tissures and upon abiotic stress
Isolation of a wheat cDNA fiagment with homology to auxin response factor 2 from rice
Discussion
References
第四章 小麦脂质转运蛋白的cDNA的克隆及功能分析cDNA Cloning and Functional Analysis of Lipid Transfer Protein of Wheat
Abstract
1 Materials and Methods
1.1 Plants and pathogens
1.2 Different treatments
1.3 Total RNA isolation and cDNA synthesis
1.4 Amplification, recovering and cloning of LTP full-length cDNA
1.5 DNA sequence analysis and clustal analysis
1.6 Semi-quantitative RT-PCR analysis of transcripts
1.7 Transient expression analysis
2 Results
2.1 Isolation of full-length cDNA encoding LTP
2.2 The comparison analysis of the coding region of LTP in A, S, AB, D and ABD genome
2.3 Differential expression of LTP (LTP1+LTP2) upon powdery mildew fungus infection
2.4 Differential expression of LTP (LTP1+LTP2) upon abiotic stress
2.5 Differential expressions of LTP (LTP1+LTP2) in different tissues
2.6 LTP1 over expression
Discussion
References
致谢
附录
发布时间: 2007-09-18
参考文献
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- [2].CHH甲基化参与调控小麦白粉病防御路径的分子机制研究[D]. 耿帅锋.中国农业科学院2016
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