论文摘要
J亚群禽白血病病毒（Subgroup J of Avian Leukosis Virus,ALV-J）是上世纪80年代末从肉用型鸡中分离鉴定出来的禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus, ALV）新的亚群,严重影响了肉鸡业的健康发展。从广东某些黄羽种鸡场疑似ALV-J感染的肉鸡中进行ALV-J的分离,通过接种鸡胚成纤维细胞（CEF）、聚合酶链式反应（PCR）技术及特异性单抗的间接荧光抗体反应（IFA）,首次从中国地方品系-黄羽肉鸡中分离到J亚群白血病病毒（ALV-J）,分别命名为GD0510A、GD0510B和GD0512。并对其gp85基因和3′末端序列及其致病性作了比较分析。结果显示,GD0510A、GD0510B和GD0512的gp85基因编码的氨基酸序列与国内毒株HN0001同源性最高,分别为94.1%、92.5%和95.8%, GD0510A和GD0512的3′末端核酸序列与国内毒株同源性高于与国外株同源性。分子生物学特性研究表明该毒株可能是来自国内白羽肉鸡,且也能造成感染肉鸡的免疫抑制。将分离到的两株ALV-J（GD0510A和GD0512）感染1日龄肉鸡后出现明显生长抑制（P<0.05）,并诱发中枢免疫器官法氏囊和胸腺萎缩。GD0510A和GD0512两株病毒单独感染均能降低鸡体对新城疫病毒和禽流感病毒（AIV-H5）疫苗的抗体滴度。其中GD0512感染鸡后能明显抑制感染鸡对新城疫病毒疫苗的免疫反应（P <0.05）,而GD0510A感染鸡后在4w时也能明显抑制感染鸡对禽流感病毒（AIV-H5）疫苗的免疫反应（P <0.05）。迄今为止,关于ALV-J的囊膜糖蛋白基因分子流行病学的报道已有许多,在这些报道中,都是比较了大量野毒株的gp85基因的氨基酸序列,并根据其有义突变（NS）与沉默突变（S）的比例来分析gp85基因上存在的高变区,并以此来显示免疫选择压作用在病毒变异和演化中的作用。本实验室已首次尝试在严格试验控制条件下显示免疫选择压对ALV-J野毒gp85变异的影响。本研究则采用不同毒株在实验室条件下进一步比较研究ALV-J的gp85基因在免疫选择压下的演化。本研究将ALV-J中国分离野毒HN0001株未经纯化毒和NX0101株分子克隆化病毒cNX0101各自腹腔接种7日龄SPF鸡中,42天后采血,用IFA试验测其各自的抗体效价,取抗体水平最高的一份作为免疫选择压的单因子血清来源。通过初步血清病毒中和试验,确定加入到培养基中去的抗体浓度HN0001株为1:200,cNX0101株为1:100,既能构成抗体免疫选择压又不至于完全中和病毒。将原代病毒HN0001株和cNX0101株各自接种鸡胚成纤维细胞（CEF）,每株病毒均分为培养基中无特异性抗体组和培养基中含特异性抗体组,每组设3个独立的传代系列,病毒在细胞上每培养6d记为一代。分别对第10代、第20代和第30代病毒的囊膜糖蛋白（env）基因进行了克隆和测序,并将传代病毒的gp85蛋白的氨基酸序列与原代病毒进行了比较,并通过计算NS与S的比值,以显示抗体免疫选择压对ALV-Jgp85基因变异的影响。免疫选择压下,未纯化病毒NX0101的传代结果中,有抗体组发生了规律性变异,而无抗体组则只出现了一些随机性变异。经纯化的分子克隆化病毒cNX0101则与此不同,在其传代结果中,有抗体组和无抗体组不同代次gp85氨基酸序列与原代病毒相比,从低代次起出现了几乎一致的规律性变异。这是因为克隆化病毒为单一起源的病毒,免疫压力无法起选择作用。而同为未经纯化的病毒HN0001株则与未经纯化的病毒NX0101株相同,对gp85高变区上有义突变（NS）与沉默突变（S）的比例计算分析表明,有抗体组在182～194aa高变区域上出现多个碱基突变,其NS/S的值为5（5/1）,无抗体组在182～194aa高变区域上仅有一个碱基突变,且NS/S的值为0（0/1）。而且,有抗体组在182～194aa区域内,变异在低代次出现后,在高代次继续维持这一变异。这说明免疫选择压在未经纯化的野毒HN0001的变异中发挥了选择性作用。本研究结果显示,抗体这一免疫压力在病毒的变异中可能只起选择性作用,而不起促进变异的作用。
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