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植酸酶phyA基因在解脂耶氏酵母中的表达研究

2020-12-08阅读(350)

植酸酶phyA基因在解脂耶氏酵母中的表达研究

论文摘要

植酸酶近年来成为一种新型的绿色饲料添加剂,由于它能把植酸降解为肌醇和无机磷,可以提高饲料的利用率,降低成本,并减少对环境的污染,因而广泛应用于饲料、食品、医药工业以及环境保护。但由于天然植酸酶的热稳定性限制了植酸酶在生产用的应用。解脂耶氏酵母可作为一种优良的表达宿主,它被认为是安全的,能用于食品和药物生产中,并能利用很多普通的碳水化合物和脂肪作为碳源,使其更适合不同的工业应用。本研究通过选用解脂耶氏酵母的表达载体PT14（改造的pINA1296载体）和pINA1297,构建出重组PT14-phyA和pINA1297-phyA解脂耶氏酵母菌株,期望能够得到大量活性高及热稳定性好的重组酶。目前,国内外还没有用PT14和pINA1297表达植酸酶phyA的报道。研究方法和内容如下:1.植酸酶phyA基因的克隆:利用氯化钠法提取毕赤酵母GS115-phyA总基因组DNA,以其总DNA为模板,根据黑曲霉NRRL3135植酸酶phyA基因序列设计出两对引物,通过PCR方法扩增出不含有信号肽和内含子的PT14phyA和1297phyA两种植酸酶phyA片段,其中PT14phyA含有LacO编码基因中的7个碱基,1297phyA片段中含有SfiⅠ和KpnⅠ两个限制性酶切位点。2.将扩增出的PT14phyA片段与解脂耶氏酵母po1g的表达载体表达载体PT14进行连接,构建出重组表达载体PT14-phyA,PT14-phyA经NotⅠ线性化用电击转化方法转化到解脂耶氏酵母po1g中,利用MD和含有植酸钙的PPB平板初筛出重组解脂耶氏酵母po1g。将筛选出的重组解脂耶氏酵母po1g接入到PPB液体培养基中进行诱导培养,表达的植酸酶酶活第四天时达到最大为22.75 U/mL,表达的植酸酶最适pH值为5.5,最适反应温度为55℃,热稳定性也比较高,经过90℃处理10 min后还有62.47%的残留活性,并且其抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶能力也较强。3.将扩增出的1297phyA片段与解脂耶氏酵母po1h的表达载体表达载体pINA1297进行连接,构建出重组表达载体pINA1297-phyA,pINA1297-phyA经NotⅠ线性化后用醋酸锂转化方法转化到解脂耶氏酵母po1h中,利用YNBcasa和含有植酸钙的PPB平板初筛出重组解脂耶氏酵母po1h。将筛选出的重组解脂耶氏酵母po1h接入到YM液体培养基中进行培养,表达的植酸酶酶活第六天时达到最大为636.23 U/mL。表达上清经SDS-PAGE分析得到表达植酸酶分子量约为130 kD,但通过去糖基化处理后其分子量变为51 kD,与理论值相符。经过酶学性质分析表明重组植酸酶最适pH为5.5,最适温度为55℃,该酶经过pH2.0-8.0处理1 h后仍有80%酶活,并且90℃处理10 min后还有86.08%的残留酶活,比其它以酵母为宿主菌所表达的植酸酶phyA酶活的热稳定性都高,其用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理2 h后仍有97.08%和88.85%的酶活性。37℃,pH为5.5条件下测得的表达植酸酶对植酸钠的Km值为0.187 mmol/L。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 文献综述
  • 1.1 植酸酶及其种类
  • 1.2 植酸酶的来源
  • 1.3 植酸酶的特性
  • 1.4 植酸酶作用机理
  • 1.5 植酸酶的应用
  • 1.5.1 植酸酶在食品工业中的应用
  • 1.5.2 植酸酶在饲料工业中的应用
  • 1.5.3 植酸酶在医药行业中的应用
  • 1.6 植酸酶的基因工程
  • 1.6.1 植酸酶在原核微生物中的表达
  • 1.6.2 植酸酶在真核微生物中的表达
  • 1.7 本研究的目的和意义
  • 2 实验内容
  • 2.1 实验材料与仪器
  • 2.1.1 菌种
  • 2.1.2 质粒
  • 2.1.3 培养基
  • 2.1.4 酶和试剂
  • 2.1.5 试验仪器
  • 2.1.6 实验用溶液的配制
  • 2.1.7 实验用植酸钙的配制
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 植酸酶重组毕赤酵母总DNA 提取
  • 2.2.2 植酸酶phyA 基因的克隆
  • 2.2.3 解脂耶氏酵母po1g 表达载体PT14-phyA 的构建
  • 2.2.4 解脂耶氏酵母po1g 的转化
  • 2.2.5 重组解脂耶氏酵母的筛选
  • 2.2.6 重组植酸酶的诱导表达
  • 2.2.7 重组植酸酶的酶学性质研究
  • 2.2.8 解脂耶氏酵母表达载体pINA1297-phyA 的构建
  • 2.2.9 重组解脂耶氏酵母的转化及筛选
  • 2.2.10 重组酵母菌株的表达
  • 2.2.11 SDS-PAGE 凝胶的制备及发酵液上清液的蛋白质电泳
  • 2.2.12 重组植酸酶酶活性研究
  • 2.2.13 重组植酸酶的胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性研究
  • 3 结果与分析
  • 3.1 植酸酶重组毕赤酵母总DNA 提取
  • 3.2 植酸酶phyA 基因片段的克隆
  • 3.3 解脂耶氏酵母重组表达载体的构建
  • 3.3.1 解脂耶氏酵母po1g 重组表达载体的构建
  • 3.3.2 解脂耶氏酵母po1h 重组表达载体的构建
  • 3.4 重组表达载体的线性化
  • 3.5 酵母的转化与筛选
  • 3.6 重组植酸酶phyA 的诱导表达
  • 3.7 重组解脂耶氏酵母表达产物的SDS-PAGE 鉴定
  • 3.8 表达产物的酶学性质研究
  • 3.8.1 重组植酸酶phyA 的最适pH 值
  • 3.8.2 重组植酸酶phyA 的最适反应温度
  • 3.8.3 重组植酸酶的pH 耐受性
  • 3.8.4 重组植酸酶phyA 的耐热性研究
  • 3.8.5 重组植酸酶米氏常数（Km）的测定
  • 3.9 酶的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性研究
  • 4 讨论
  • 4.1 植酸酶phyA 基因的克隆
  • 4.2 重组表达载体的构建
  • 4.3 重组解脂耶氏酵母的表达
  • 参考文献
  • 致谢
  • 研究生在校期间的研究成果

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