RNA干扰抑制人肺癌细胞HMGB1基因表达的实验研究

论文摘要

背景和目的肺癌是严重威胁人类健康和生命的恶性肿瘤，其发病率将在相当长时期内呈现显著上升趋势，已成为引起世界上癌症死亡率最主要原因1。高迁移率族蛋白B1（high mobility group box B 1，HMGB1），是一种存在于真核生物细胞内的非组蛋白染色体结合蛋白，参与多种生物学过程包括诸如基因转录、DNA修复等功能。HMGB 1过表达有抑制细胞凋亡，诱导细胞分化、细胞迁移、细胞增殖等作用2。最近研究表明它不但是一种转录因子和促生长因子，而且是一种重要的炎性细胞因子，并与肿瘤的发生、浸润、转移等生物学行为关系密切，有很大的临床价值3。HMGB1在肺癌中的研究处于起步和探索阶段。国内外并无其他关于HMGB1在肺癌中全方位系统性研究的文献报道。本研究在人肺鳞癌细胞株YTMLC-9、人肺腺癌细胞株A549、人大细胞肺癌细胞株L9981及人小细胞癌细胞株NCI-H446中筛选高表达HMGB1的细胞株，作为人肺癌细胞HMGB1基因研究的理想材料，为下一步进行的RNAi实验研究的细胞模型的选择奠定了基础；设计针对HMGB1为靶点的siRNA，观察通过RNA干扰抑制HMGB1基因表达后，高表达HMGB1的人肺癌细胞株L9981增殖和侵袭能力的改变，体外验证HMGB1基因做为治疗靶点的可行性；为临床开发应用和探索肿瘤治疗的新途径提供实验和理论基础；应用RNA干扰联合基因芯片技术检测HMGB1表达下调后肺癌细胞基因表达谱的差异情况，筛选与HMGB1相互作用的基因及可能的信号通路，探讨HMGB1基因在肺癌中的作用机制。方法1、常规培养人肺鳞癌细胞株YTMLC-9、人肺腺癌细胞株A549、人大细胞肺癌细胞株L9981及人小细胞癌细胞株NCI-H446，采用实时荧光定量PCR和Westernblot方法对人肺癌细胞HMGB1基因在4株细胞中的mRNA和蛋白水平的表达进行检测，筛选出高表达HMGB1基因的人肺癌细胞株。2、根据siRNA设计原则，设计合成靶向HMGB1基因的siRNA，采用阳离子脂质体试剂瞬时转染已经筛选出的高表达HMGB1的人大细胞肺癌细胞株L9981，利用实时荧光定量PCR和Western blot检测RNA干扰后HMGB1基因的沉默效果，评价siRNA设计的合理性及RNA干扰抑制HMGB1表达的有效性；确定RNA干扰抑制HMGB1表达确实有效后，培养人大细胞肺癌细胞株L9981，分为3组进行RNA干扰研究，分别为转染靶向HMGB1基因的siRNA组，转染无关序列组和空白对照组，于RNA干扰后48小时，用细胞活力计数仪测定3组细胞活力；分别在RNA干扰后24、48、72和96小时应用MTT实验检测3组细胞生存状态，计算生长抑制率并绘制生长曲线；应用boyden chamber法检测3组侵袭能力的差异。3、采用阳离子脂质体试剂向人肺癌细胞L9981转染靶向HMGB1基因的siRNA，下调HMGB1的表达。应用Affymetrix HU133 plus 2基因芯片检测人肺癌细胞L9981 HMGB1基因表达下调后，全基因表达谱的变化，并应用GCOS（Gene-ChipOperation Software）软件分析筛查数据，对相关基因和信号通路进行综合分析。结果：1、人肺鳞癌细胞株YTMLC-9、人肺腺癌细胞株A549、人大细胞肺癌细胞株L9981及人小细胞癌细胞株NCI-H446中均有HMGB1基因表达，其中人大细胞肺癌细胞株L9981表达水平最高，mRNA是表达量最低的人肺腺癌细胞株A549mRNA表达量的10．3倍，人大细胞肺癌细胞株L9981与其它3种人肺癌细胞株比较差异有统计学意义（P＜0．01）2、靶向HMGB1的siRNA成功抑制人大细胞肺癌细胞株L9981中HMGB1基因及蛋白表达（P=0．000），细胞活力检测仪测定RNA干扰48小时后，空白对照组和阴性对照组细胞活力显著大于siRNA转染组；MTT测定siRNA转染组细胞生长抑制率显著大于空白对照组和阴性对照组；boyden chamber小室细胞侵袭实验结果siRNA转染组穿膜细胞数明显减少，与空白对照组和阴性对照组比较，差异有显著性（P＜0．05）。3、RNA干扰抑制人大细胞肺癌细胞株L9981HMGB1基因表达后，GCOS软件分析基因芯片分析其表达谱的变化。结果发现1433个探针表达明显改变，对应有明确名称的基因为879个，其中上调的基因有295个，下调的有584个；EST序列216个，其中上调96个，下调120个。差异基因共涉及131个信号通路，主要为肺癌、钙信号通路、细胞通讯、细胞因子受体相互作用、ErbB信号通路、细胞基质黏附、细胞迁移、细胞信号转导、Jak-STAT信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路、细胞周期、细胞凋亡以及Wnt信号通路等相关通路。经过Milano网站分析，其中678个基因有报道。在这678个基因中，与肺癌（检索词lung cancer）有相关文献报道的有209个，与癌症（检索词cancer）有相关报道的有526个，与侵袭（检索词invasion）有相关报道的有170个，或转移（检索词metastasis）有相关报道的有194个。结论：1、本研究在国内外首次报道HMGB1在人肺鳞癌细胞株、腺癌细胞株、大细胞癌细胞株及小细胞癌细胞株等4株肺癌细胞中的表达水平，筛选出HMGB1高表达的人肺癌细胞株L9981，HMGB1低表达的人肺癌细胞株A549，人大细胞肺癌L9981细胞株为HMGB1高表达细胞株，可作为进行肺癌细胞中研究HMGB1的实验材料。2、成功设计了靶向HMGB1的siRNA，应用RNA干扰技术在国内外首次将靶向HMGB1的siRNA转染至筛选出的高表达HMGB1的肺癌细胞株中，并成功的高效地下调人肺癌细胞L9981HMGB1基因的表达，成功构建了转染HMGB1的siRNA的肺癌细胞株和转染无关序列的肺癌细胞株。人肺癌细胞L9981HMGB1基因下调后，细胞增值和侵袭能力显著被抑制，表明HMGB1可作为人肺癌基因治疗潜在的靶点。3、本研究在国内外首先应用表达谱芯片研究人肺癌细胞L9981HMGB1基因下调后，其细胞基因表达谱变化情况，确定表达差异基因879个，主要涉及肺癌、钙信号通路、细胞通讯、细胞因子受体相互作用、ErbB信号通路、细胞基质黏附、细胞迁移、细胞信号转导、Jak-STAT信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路、细胞周期、细胞凋亡以及Wnt信号通路等方面。经过Milano网站分析，其中678个基因有报道。在这678个基因中，与肺癌（检索词lung cancer）、侵袭和转移（检索词metastasis）报道较多的基因中。筛选出与肺癌、侵袭和转移相关报道较多的基因进行分析，其中上调的基因功能主要有血管形成、细胞通讯、抗凋亡、细胞增殖正调控和细胞迁移正调控等；在下调的基因中，主要功能与信号转导、细胞之间信号联系、细胞粘附、细胞与基质黏附、细胞周期调控、DNA修复、DNA复制、细胞迁移、细胞分化、细胞生长、细胞增殖和钙离子通道有关。表明HMGB1基因表达受很多相关基因及信号通路的调控，与肺癌的侵袭、转移及肺癌形成等生物学过程密切相关，其分子机制有待进一步深入探讨。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、HMGB1基因在人肺癌细胞株A549、L9981、NCI-H446和YTMLC-9中的表达研究
• 1.1 对象和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、RNA干扰抑制HMGB1表达对人肺癌细胞株L9981的生物学行为影响
• 2.1 对象和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、RNA干扰抑制人肺癌细胞株L9981HMGB1基因表达后基因表达谱变化的研究
• 3.1 对象和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 肺癌淋巴结转移分子标志物检测研究进展
• 综述参考文献
• 致谢