含功能基肽核酸单体的合成

论文摘要

1991年，哥本哈根大学的Riso实验室的Nielsen等人以酰胺键连接的N-（2-氨乙基）甘氨酸骨架单位代替了核酸中磷酸二酯键连接的核糖-磷酸骨架单位，设计合成了肽核酸（peptide nucleic acid，简称PNA）。在PNA分子中，天然核酸碱基通过亚甲基羰基连在骨架甘氨酸的氮原子上，形成了类似多肽骨架的核酸分子。PNA的空间结构是DNA和RNA非常好的模拟物，保留了与互补DNA或RNA及PNA之间以碱基配对原则结合的能力，而且这种结合遵从Waston-Crick氢键结合的原则。PNA／DNA和PNA／RNA的复合物要比相应的DNA／DNA和RNA／RNA稳定得多。由同聚嘧啶PNA和同聚嘌呤DNA形成的（PNA）2／DNA则具有更高的稳定性。而且，PNA与DNA和RNA之间的杂交热稳定性有以下特点：（1）PNA-DNA杂交不受离子强度的影响；（2）PNA-PNA>PNA-RNA>PNA-DNA>DNA-DNA。而聚酰胺的骨架特点使PNA可以采用经典的Fmoc／tBu或Boc／Bzl固相多肽合成策略制备，操作简单、费用低、效率高，并可适当放大量制备。与DNA或RNA相比，PNA具有更好的化学和生物学稳定性，不易被核酸酶和蛋白酶降解；PNA结构中无电负性磷酸二酯键的连接桥而呈电中性，避免了与血浆相互作用，从而降低了其非特异性作用发生的可能。但是，由于PNA自身电中性骨架的结构特点，使其在水溶性和生物学利用度等方面表现较差，并且具有自聚倾向，这些缺点是目前其在应用领域的主要障碍。迄今已有多种对PNA骨架和碱基的修饰，其主要目的是改善经典PNA的水溶性，增强杂交亲和力和序列选择性，提高生物利用度，拓展PNA在分子生物学领域的应用。对PNA单体的结构改造与修饰主要分为以下几个部分：（1）骨架的修饰；（2）碱基的修饰；（3）骨架和碱基同时修饰。骨架的修饰：对PNA单体的骨架修饰的方式是多种多样的，概括起来主要有以下几种：（1）单体两端化学活性位点（N端和C端）修饰；（2）改变单体从N端到C端之间的键数，即改变骨架长度；（3）用手性氨基酸代替甘氨酸在α位引进修饰基团；（4）用手性氨基酸在γ位引进修饰基团；（5）在单体N端和C端之间引入环状结构。碱基的修饰：主要是在碱基上的某些位点进行修饰或者用其它含氮基团代替核酸碱基。因为所改造的PNA序列将用于形成高级结构，因此对单体的改造必须不影响碱基间氢键的形成。（1）脲嘧啶的5位引入官能团，因为这个位点不参与氢键的形成，不会引入大的立体化学障碍。（2）引入伪胞嘧啶，2，6-二氨基嘌呤等天然碱基的类似物。（3）胸腺嘧啶和胞嘧啶杂环化修饰。（4）引入能够进行荧光标记的碱基。骨架和碱基同时修饰：目前，大多是在骨架或碱基上分别对PNA单体进行修饰，同时进行修饰的单体尚未见报道。碱基和骨架同时进行修饰，要充分考虑保护基的正交性原则，以利于肽核酸的序列合成。除了考虑氨基的保护外，还要考虑氨基酸侧链的保护；在碱基上引入保护基时，也要充分考虑到与骨架上氨基保护基和氨基酸侧链保护基之间的正交保护问题。2002年，ISIS公司购买了PNA的相关专利，准备将其发展为第三代反义寡聚核苷酸，这标志着PNA成为药物的前景已逐渐被看好。肽核酸能与DNA和RNA特异性结合及化学和生物学稳定性等特性使其在分子生物学领域得到了广泛的应用，也带动与之相关的化学、分子生物学和生物技术领域的发展。目的：由于经典肽核酸自身功能基较少，缺乏参与生物和化学活性的官能团，结合课题组进行的利用PNA高级结构，进行结构与功能关系的探索研究的需要，本课题从碱基和骨架两方面引入功能基。（1）利用尿嘧啶的5位引入羧甲基官能团；（2）将骨架中的甘氨酸以丝氨酸或天冬氨酸代替，在骨架中引入羧基和羟基。方法：在PNA序列的固相合成中采用了Boc／Bzl保护策略，要求单体的羧基部分游离，氨基采用叔丁氧羰基加以保护。为满足固相合成的需要以及单体合成过程中保护基的稳定，我们在骨架和碱基的合成中采用了相应的保护基团。对于骨架，我们以临时性保护基叔丁氧羰基和烯丙基分别保护骨架两端的氨基和羧基，以半永久性基团苄基保护骨架中氨基酸侧链基团；对于碱基部分，我们采用半永久性保护基苯甲酰基和苄基，分别保护腺嘌呤的环外氨基和5-羧甲基尿嘧啶的羧基；这些半永久性保护基确保了这些引入功能基在单体的合成和序列合成过程中的稳定性。最后这些半永久性保护基经氟化氢裂解全部脱除。结果：结合文献，按照设计的路线完成了反应，共合成肽核酸单体6个，其中以下2个单体未见文献报道。（1）N-（2-叔丁氧羰基氨基乙基）-N-[5-（苄氧羰基乙基）尿嘧啶-1-乙酰基]-O-苄基-L-丝氨酸，其结构与核磁共振氢谱和质谱数据如下：1HNMR（DMSO-d6，400 MHz）：12．84（s，1H，-COOH），11．45（s，1H，-CO-N（?）-CO），7．33-7．36（m，11H，2-C6（?）5 and C=C（?）），5．11（s，2H，-COO-C（?）2-Ar），4．0-4．68（m，5H，-O-C（?）2-Ar，-C（?）-C（?）2-OBzl），3．0-4．0 （m，8H，-N-C（?）2-CO-N-，BocNH-C（?）2-C（?）2，-C-C（?）2CO-,），1．3 5[s，9H，-C（C（?）3）3]ESI-MS（m／z）：C32H38N4O10638．26，found 637．6（2）N-（2-叔丁氧羰基氨基乙基）-N-[5-（苄氧羰基乙基）尿嘧啶-1-乙酰基]-β-O-苄酯-L-天冬氨酸，其结构，核磁共振氢谱和质谱数据如下：1HNMR（DMSO-d6，400 MHz）：12．84（s，1H，-COO（?）），11．45（s，1H，-CO-N（?）-CO-，），6．93-7．37（m，12H，2-C6（?）5，C=C（?） andBocN（?）-），5．10（d，4H，2-C（?）2-Ar），4．64（s,2H,-N-C（?）2-CO-），4．39（t，1H，-C（?）-CH2-），2．76-3．35（m，8H，-N-COC（?）2-N-，BocNH-C（?）2-C（?）2-，-CH-C（?）2-），1．3 5[s，9H，-C（C（?）3）3]ESI-MS（m／z）：C33H38N4O11666．68，found 665．5结论：1在合成过程中，采用了合适的正交保护策略。2中间体（3）合成中，通过降低反应温度和苯甲酰氯的滴加速度，减少副产物。3由于中间体（7）溶解性较差，采用一般的酯化方法收率较低。而采用缩合剂酯化的方法收率较高。4中间体（8）与溴乙酸叔丁酯反应时，1位和3位氮上的氢都会被取代，降低反应温度可以减少3位氮上氢被取代的情况。5 Pd（PPh3）4可以选择性的脱掉烯丙基，但收率不高。6化合物（19）在无水乙醚中用LiAlH4还原时，应严格控制反应时间，大约7min便完全反应，时间过长则被进一步还原。7对于有空间位阻的反应物，用HBTU作缩合剂时，效率较低。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 含功能基肽核酸单体的合成
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 参考文献
• 综述 肽核酸碱基修饰研究进展
• 致谢
• 个人简历