紫草抗胚胎植入作用与Muc1蛋白在子宫内膜表达的关系

论文摘要

目的：胚胎着床（implantation）也称胚胎植入或胚胎粘附,即处于接收状态的子宫内膜与活化状态的胚胎相互作用,最终胚胎滋养层和子宫内膜建立密切联系的过程。根据对胚胎植入敏感性不同,子宫可分为接受前期（prereceptive）、接受期（receptive）、及非接受期（refractory）。子宫处于接受态的时期又称“着床窗口（implantation window）",此时,子宫内膜允许胚胎植入,但持续时间很短。胚胎植入的过程分为定位期（apposition）、粘附期（attachment）、和侵入期（invasion）。但子宫内膜接受性和胚胎活化状态是两个独立事件,只有同步进行,胚胎才能正常植入。在植入过程中,有许多粘附分子和抗粘附分子发挥作用,粘蛋白1（Mucl）便是抗粘附分子之一。Mucl蛋白在植入窗口期通过有规律的消失来允许胚胎植入。中药紫草（Lithospermum erythrorhizon）是一种抗生育临床常用药,具有悠久的历史。已有研究证明紫草在多种哺乳动物中具有抗生育效果,但作用机理尚不甚明确。所以我们采取昆明小白鼠为研究对象,应用苏木素-伊红（HE）方法、免疫组织化学染色（immunohistochemistry）、免疫印迹法（Western blot）等研究紫草在胚胎植入过程中对子宫内膜及Mucl蛋白的影响,以期阐明紫草抗植入的机理。方法：将未经产雌性昆明小白鼠与具有正常生育能力的雄性昆明小白鼠或输精管结扎的雄性昆明小白鼠按2：1合笼,次日早7点查见阴栓者,为真孕或假孕第一天。（1）取168只真孕小鼠随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ实验组及对照组,每组42只。在受精后的第1、2、3、4天上午8时,实验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的孕鼠分别经胃灌服浓度为0.35g/mL、0.525g/mL、0.7g/mL的紫草浸液,对照组灌服等体积的生理盐水。第4天晚上22：00点,每组取12只孕鼠脱臼处死,剖腹取出Y形子宫,一侧固定进行常规石蜡包埋,连续切片,用于HE染色和免疫组化染色,另一侧子宫置-80℃冰箱保存,用于Western blot检测；第8天上午8：00点,每组取15只孕鼠颈椎脱臼处死,观察胚胎植入率和紫草对小鼠胚胎植入的生物学效应；每组剩余的15只雌鼠继续妊娠,观察紫草抗生育情况,待产仔后30天重新交配再次观察产仔情况。（2）取真孕第一天60只雌鼠随机分为4组,每组15只。在受精后的11-14天,上午8时,实验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的孕鼠分别经胃灌服浓度为0.35g/mL、0.525g/mL、0.7g/mL的紫草浸液,对照组灌服等体积的生理盐水。至第18天,孕鼠脱臼处死观察胚胎存活情况。（3）取假孕母鼠48只随机分为4组,每组12只,在假孕后的第1、2、3、4天上午8：00点,实验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的孕鼠分别经胃灌服浓度为0.35g/mL、0.525g/mL、0.7g/mL的紫草浸液,对照组灌服等体积的生理盐水。第4天晚上22：00,每组取12只孕鼠脱臼处死,剖腹取出Y形子宫,一侧固定进行常规石蜡包埋,连续切片,用于HE染色和免疫组化染色,另一侧子宫置-80℃冰箱保存,待Western blot检测。结果：1.紫草抗胚胎植入结果：在实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及对照组中,每组有胚胎成功植入的雌鼠数分别为6、4、1、15,每组的植入位点平均数分别为6.17±0.79、5.25±0.95、4、10.40±0.52,抗植入率分别为40%、73.3%、93.4%、0。2.紫草抗生育可逆性结果：在实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及对照组中,每组雌鼠第一次怀孕数分别为7、4、1、15,每组产仔的平均数分别为5.28±0.64、3.75±0.48、3、10.54±0.62；每组雌鼠第二次怀孕数分别为15、15、15、15,每组产仔的平均数分别为11.11±0.52、9.47±0.57、10.33±0.59、10.54±0.56。3.紫草终止妊娠流产结果：在实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及对照组中,每组怀孕雌鼠数分别为：8、7、4、15,每组怀孕雌鼠的平均植入位点分别为：8.38±0.67、7.14±0.51、5.75±0.48、10、33±0.57。4.HE染色结果：实验组子宫内膜上皮细胞排列紊乱,随着药量增加,紊乱程度增加。5 Mucl蛋白表达结果：免疫组化染色和Western blot结果显示,真孕雌鼠实验组子宫内膜Mucl蛋白表达量增加,与灌服药量成正相关,假孕雌鼠实验组子宫内膜Muc1蛋白表达量亦增加。真孕雌鼠和假孕雌鼠对应组别的Muc1蛋白表达量一致。结论：1.紫草具有明显的抗胚胎植入作用,实验组的胚胎植入成功的雌鼠数和植入成功雌鼠的平均植入位点都明显减少。2.紫草作为抗生育药具有很好的可逆性,用药30天后可以恢复正常生育能力。3.紫草具有终止妊娠的流产效果,但不如抗胚胎植入效果明显。4.紫草可以影响子宫内膜上皮细胞的形态和排列。5.紫草能干扰子宫内膜Muc1蛋白表达的消失从而阻止胚胎着床。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 前言
• 实验材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 仪器设备
• 1.4 溶液配制
• 2 实验方法
• 2.1 动物实验模型的建立
• 2.2 制作石蜡切片
• 2.3 H-E染色
• 2.4 免疫组织化学染色
• 2.5 Western blot
• 2.6 统计学处理
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附表图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位论文期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表