论文摘要
随着我国老龄化人口的急剧增多,中枢神经系统脱髓鞘疾病发生率迅速增高。少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞,脱髓鞘疾病发生后促进髓鞘再生有赖于对少突胶质细胞发育分化和髓鞘形成机制的进一步研究,这一过程受生长因子、激素、胞外基质相关分子等多种因素的调控,胞内转录因子Sox10、SCIP、Krox24以及大量含螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix,HLH）结构域的转录因子等发挥了重要作用。HLH蛋白可分为两类:碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix, bHLH）和DNA结合抑制物（inhibitor of DNA binding,Id）。Id蛋白家族包括Id1、Id2、Id3和Id4四种。Id2广泛参与T细胞发育、肿瘤增殖、细胞周期调控、肌肉发生以及神经系统发育等生物学功能。Id2蛋白在离体视神经OPCs分化为少突胶质细胞过程中发挥重要作用,当过表达Id2时可显著抑制少突胶质细胞分化;而当缺乏Id2时,可促进诱导形成未完全成熟的少突胶质细胞。Id2在离体培养的大鼠脑的少突胶质前体细胞成熟过程中也有重要作用。Id2在成年小鼠脑内广泛分布30,但Id2在成年大鼠脑内的分布有何特征和规律呢?即Id2究竟在哪些区域的表达最强和可能发挥重要作用呢? Id2究竟在大鼠大脑内哪种类型的细胞中表达和发挥功能呢?Id2究竟在成年大鼠脑少突胶质细胞发育分化中的哪些阶段发挥作用呢?结果显示Id2在视交叉、前嗅核、海马伞、锥体束等部位呈高表达,在胼胝体和扣带的表达最强,且90%的Id2阳性细胞为少突胶质谱系的细胞,在大脑终末分化的少突胶质细胞中高表达。由此提示Id2可能在少突胶质细胞的终末分化和髓鞘形成中发挥重要作用。观察Id2在扣带少突胶质细胞发育分化中的表达模式有助于了解Id2在扣带少突胶质细胞的发育分化和髓鞘形成中发挥怎样的作用?因此,我们观察了Id2在发育不同时期扣带内的表达模式。溴化乙锭（EB）局部注射的脱髓鞘后髓鞘再生的模型内有少突胶质细胞的发育分化形成髓鞘的现象,观察Id2在脱髓鞘模型中的表达变化有助于弄清Id2是否参与了少突胶质细胞的发育分化和髓鞘形成的过程。那么Id2在扣带区髓鞘再生的过程中变化如何呢?其调控髓鞘再生的机制是什么呢?转录因子Olig是2000年发现的一类B型bHLH转录因子家族,其中Olig1和Olig2与少突胶质细胞发育分化和髓鞘形成密切相关。Olig1蛋白新生期定位于细胞核,2周龄大部分移位到了细胞浆,成年均位于细胞浆。Olig1蛋白脱髓鞘病变发生后也出现相似的核浆移位现象:当OPCs对损伤发生应答时,可见Olig1蛋白从细胞浆移位到细胞核;当髓鞘再生完成后,Olig1蛋白又重新转移至细胞浆;但是当出现髓鞘再生障碍时,大部分OPCs （oligodendrocyte progenitor cells）中的Olig1蛋白却定位在细胞浆。因此Olig1蛋白在髓鞘再生过程中是否发生核-浆移位,可能是Olig1蛋白参与髓鞘修复的关键机制。Olig2基因缺失的动物脑中的少突胶质祖细胞OPCs明显减少,不能形成正常的少突胶质细胞,在脊髓中甚至完全缺乏OPCs,因而也最终影响了髓鞘的形成;在Olig1和Olig2基因同时缺失时会导致全脑不能形成少突胶质细胞,严重影响髓鞘形成。Olig2主要促进OPCs的增殖和向少突胶质细胞分化,而Olig1则主要促进少突胶质细胞的进一步成熟和形成髓鞘。Id2可与属于A型bHLH的E蛋白结合形成二聚体,阻断与属于B型bHLH的转录因子Olig的结合,从而负向调控Olig的作用。在小鼠侧根神经节干细胞分化过程中,研究证实Id2与Olig1和Olig2有共存表达,且能够相互结合,Id2抑制Olig影响了BMP4对神经节干细胞分化为少突胶质细胞的抑制。那么在扣带髓鞘再生的过程中,Id2是否能和Olig1、Olig2结合从而抑制Olig的作用,进而调控髓鞘再生呢?因而我们在观察Id2在脱髓鞘模型中的表达变化的同时,观察了Id2和Olig1、Olig2的共定位情况。结果提示Id2可能通过与Olig基因相互作用来介导髓鞘再生。但Id2与Olig基因的相互作用又受其上游的什么因素调控呢?Fyn是非受体酪氨酸蛋白激酶（protein-tyrosine kinase , PTK） Src家族成员之一,Fyn在髓鞘形成起始阶段发挥重要作用。Fyn缺乏小鼠,髓鞘变薄40-50%。Fyn信号通路最后通过激活髓鞘碱性蛋白（Myelin Basic Protein,MBP,为成熟髓鞘的标志物之一）基因而在髓鞘形成中发挥重要作用;而Id2对MBP基因启动子活性则具有负向调节作用。Fyn酪氨酸激酶通过促使酪氨酸磷酸化（包括MAPK/ERK信号通路）发挥启动髓鞘形成的作用,而MAPK/ERK信号通路可调节转录因子Olig2的功能,从而诱导神经干细胞向少突胶质细胞系分化。Fyn磷酸化可能直接或者通过MAPK信号通路调节C/EBP转录因子,而Id2为C/EBP转录因子的直接下游目标基因。因此,Fyn可能调节Olig基因、或者通过调节Id2表达,而Id2通过抑制Olig基因的作用介导髓鞘再生。因此,我们进行了以下几个方面进行研究:（1）运用免疫组化单双标技术,观察了Id2在成年大鼠脑内的分布有何特征和规律?即证明了Id2在成年大鼠脑内究竟在哪些区域的表达最强和可能发挥重要作用。Id2究竟主要在大鼠大脑内哪种类型的细胞中表达和发挥功能。以及Id2究竟在大脑的少突胶质细胞的发育分化中的哪些阶段发挥作用。（2）观察了Id2在发育不同时期扣带内的表达模式和Id2在EB局部注射脱髓鞘后髓鞘再生的模型中的表达变化规律,为研究它参与调节髓鞘形成和髓鞘再生的机制奠定基础。（3）分析Id2与Olig1/2的表达变化规律和胞浆胞核共定位与Fyn表达变化和髓鞘再生的关系,利用体外培养神经干细胞诱导分化成为少突胶质细胞模型,运用fyn抑制剂,观察转录因子Id2、Olig1/2及其相互作用是否与fyn变化有关。主要得到如下结果:1、Id2在成年大鼠脑内的分布特征和规律:（1）Id2在视交叉、前嗅核、海马伞、锥体束等部位呈高表达,在胼胝体和扣带的表达最强。（2）Id2与前庭上核（sv）等神经元和小脑蒲肯野神经元共表达,约占整个大脑中Id2阳性细胞的5%。Id2与皮层、扣带等区域内GFAP+星形胶质细胞有少量共表达,约占5%。90%的Id2阳性细胞为少突胶质谱系的细胞。（3） Id2与Olig1+、Olig2+、PDGFaR+少突胶质细胞有少部分共表达,70%在CC-1+终末分化的少突胶质细胞中表达。Id2在成年大鼠脑内可能对神经元和星形胶质细胞有部分作用,可能主要在少突胶质细胞的终末分化和髓鞘形成中发挥重要作用。2、Id2在发育和脱髓鞘扣带中的表达变化:（1）Cuprizone喂养大鼠脱髓鞘不明显,EB注射大鼠扣带脱髓鞘明显。（2）Id2从P0天至成年表达逐渐增强。Id2在胚胎及出生后2周前,Id2在胞浆中表达,成年迁移至细胞核。（3）Id2的表达从EB3至EB7即随髓鞘的脱失表达逐渐降低,在EB7至EB28即髓鞘再生过程中表达逐渐增强,且在在成年脱髓鞘10天,部分移位至胞浆中表达。由于少突胶质前体细胞在出生后逐渐发育成熟,脱髓鞘模型7天后逐渐再生,Id2在此过中表达逐渐增强以及Id2在发育和再生过程中可能存在核浆转位的结果提示Id2可能在髓鞘的形成和损伤修复中发挥重要的作用。3、（1） Id2在发育和脱髓鞘扣带与Olig1的表达关系:Id2与olig1的表达模式不同,olig1在在正常生后至成年的扣带内表达均很弱,Id2表达逐渐增强。olig1的表达从EB3、EB7至EB28先增强后减弱,Id2则先减弱后增强。Olig1从P0天至成年逐渐从胞核转位至胞浆,Id2则从胞浆至胞核。Olig1从EB3、EB7至EB28从胞浆转位至胞核再到胞浆,Id2则从胞核至浆再到胞核。Id2在脱髓鞘7天时,部分在核内与Olig1共表达;脱髓鞘10天,部分在胞浆中与Olig1共表达。（2）olig2在在胞正常生后至成年的扣带内表达增强,在脱髓鞘扣带内表达先增高后减弱,Id2和olig2在细胞核中共存。（3）fyn的表达从EB3、EB7至EB28先减弱后增强,与Id2相似,Olig1、Olig2相反。离体实验显示,加入1uM fyn抑制剂PP1明显延迟少突胶质前体细胞分化成熟,Olig1的表达增强,而Id2的表达减弱;Olig1在胞浆表达,Id2转位至胞核中表达,仍然与Olig1在同一细胞中。这些结果提示Id2和Olig1之间可能存在相互作用,且Id2和Olig1表达变化和它们之间的共定位关系与Fyn的变化有关。综上所述,本文通过观察Id2在成年大鼠脑内的分布特征和规律,Fyn、Id2、Olig1、Olig2在发育不同时期和EB注射脱髓鞘模型的扣带内的表达变化及其它们间的相互作用,进一步运用离体模型、fyn抑制剂,观察Id2、Olig、Olig2及其共定位变化是否与fyn有关。结果提示Id2可能与少突胶质前体细胞的早期定向分化和髓鞘形成有关系,Id2和Olig1之间可能存在相互作用,在Id2和Olig1表达变化的同时,Fyn也发生表达变化;而离体实验进一步证明Id2和Olig1表达变化是与Fyn的变化有关系的。因此,Id2在少突胶质细胞的发育分化中发挥了重要作用,可能与Olig1/2相互作用、此相互作用可能受fyn信号通路调节介导髓鞘再生。