酿酒酵母乳酸脱氢酶发酵和酶学性质及其基因序列分析

论文摘要

在酿酒酵母的正常发酵过程中,乳酸脱氢酶催化丙酮酸还原为乳酸。高级醇是啤酒发酵中最重要的风味物质之一,大多数高级醇和酒精发酵同步形成,主要是由合成途径产生的。理论上分析高级醇的生成与乳酸的生成是反向的关系,因此可以通过增加乳酸的生成量来降低啤酒发酵中高级醇的生成量。然而在啤酒酿造中乳酸脱氢酶对高级醇的调控机制尚不清楚。本文拟研究酿酒酵母乳酸脱氢酶的发酵性质,在发酵过程中通过添加镁锌离子,调控乳酸脱氢酶的活力控制高级醇的含量。建立酿酒酵母乳酸脱氢酶分离纯化的方法,并分析不同菌株乳酸脱氢酶编码基因的序列差异,阐明不同酵母乳酸脱氢酶活力差异,为调节控制啤酒高级醇含量提供理论依据。本研究测定5株不同酿酒酵母菌株乳酸脱氢酶的发酵性质,结果表明不同酵母菌株之间的乳酸脱氢酶酶活力存在差异。在啤酒发酵过程中随着LDH活性增加,啤酒中的高级醇含量则下降,显示了LDH活性与高级醇生成量呈负相关性。通过向发酵液中添加金属离子Mg2+（500mg/L）和Zn2+（0.17mg/L）,测定发酵过程中发酵液的乳酸脱氢酶活力和高级醇生成量,结果显示Mg2+和Zn2+的添加,显著提高了酵母的乳酸脱氢酶活力,生成产物中高级醇的含量比对照降低,并且Mg2+比Zn2+的促进作用更为显著。酵母乳酸脱氢酶的分离纯化条件进行优化。结果表明:发酵液经细胞破碎,透析, 40%的（NH4）2SO4盐析, DEAE-Sepharos（eDE-52）离子交换层析,Sephadex-G25凝胶过滤等纯化步骤,分离的乳酸脱氢酶经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一蛋白条带,纯化倍数为14.3,回收率为24%。凝胶法测定该酶的分子量约为32.2kD。对酵母乳酸脱氢酶的性质测定结果表明:该酶的最适反应温度为45℃,在35℃温度下比较稳定,最适反应pH值为9.4。金属离子对该酶活性具有显著影响,在0.5 mmol/L和1.0 mmol/L的金属离子浓度下:Mg2+,Zn2+对酶活有明显的促进作用,其中1.0mmol/L Ca2+离子作用最显著,Ni+和K+对它有明显的抑制作用,Fe2+的作用不是太明显。以酿酒酵母的基因组DNA为模板,根据Genbank发表的全序列,设计3对引物,扩增LDH基因的不同片断,对扩增片断测序。对本研究中5株酵母菌株和酿酒酵母（FLH201473.01X）的LDH基因（GenBank,accession No.DQ332540）之间的序列差异进行比对分析。结果表明: YZU03与其中的ST01和SH01的差异在LDH基因的第609-725碱基之间。而它们和FLH201473.01X的LDH基因的差异在该基因的第213、216、217、228、314和315碱基。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 溶液配制
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 主要仪器与设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 酿酒酵母LDH 发酵性质研究方法
• 1.2.2 酿酒酵母LDH 分离纯化方法
• 1.2.3 酿酒酵母酶学性质的研究方法
• 1.2.4 酿酒酵母LDH 基因的PCR 扩增和序列分析
• 1.2.5 指标测定方法
• 2 结果与分析
• 2.1 酿酒酵母LDH 的发酵性质
• 2.1.1 酿酒酵母LDH 的发酵动力学
• 2+和Zn²⁺对LDH 发酵性质的影响'>2.1.2 Mg²⁺和Zn²⁺对LDH 发酵性质的影响
• 2.2 酿酒酵母LDH 的分离纯化结果
• 2.2.1 酿酒酵母LDH 的硫酸铵盐析结果
• 2.2.2 透析时间的确定
• 2.2.3 DEAE-cellulose（DE-52）层析洗脱结果
• 2.2.4 Sephadex G-25 凝胶过滤洗脱结果
• 2.2.5 酿酒酵母LDH 纯化结果
• 2.3 酿酒酵母LDH 的酶学性质
• 2.3.1 酿酒酵母LDH 酶的分子量
• 2.3.2 酶反应的最适温度
• 2.3.3 温度对LDH 稳定性的影响
• 2.3.4 酶反应的最适pH 值
• 2.3.5 金属离子对酶活性的影响
• 2.4 酿酒酵母菌株的LDH 基因的扩增与序列分析
• 2.4.1 酿酒酵母基因组DNA 提取的结果
• 2.4.2 LDH 基因的引物扩增结果
• 2.4.3 LDH 基因的序列比对结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文