水杨酸诱导甜瓜抗性相关基因的差别表达研究

论文摘要

水杨酸是一种内源小分子酚类化合物,它作为一种信号分子对某些重要的代谢过程起调控作用。目前已发现水杨酸能诱导多种植物对生物类（病毒、真菌及细菌病害）和非生物类胁迫（高温、低温、干旱和高盐等）产生抗性。通过比较1mmol/L SA诱导与未经SA诱导的甜瓜感白粉病品种卡拉克赛幼苗（两叶一心）的基因表达差异,为建立水杨酸诱导甜瓜表达序列标签并最终克隆这些基因,研究其功能奠定了基础。结果表明:1,采用Trizal法和RNA小量提取试剂盒均可从甜瓜幼苗叶片中提取到高质量的RNA。Trizal法简便、快捷、经济且提取的RNA质量较高。试剂盒提取RNA缺点在于价格高、所花费时间比Trizal法长,但是试剂盒提取RNA的质量要比Trizal法更高。2,本试验利用DDRT-PCR技术,比较了1mmol/L SA诱导第4天与未经SA诱导的甜瓜感白粉病品种卡拉克赛的基因表达差异。首先根据多态性丰富,带形分布均匀和引物重复性较高的要求筛选所有随机引物,在78对引物组合中共获得27对符合要求的随机引物,然后用随机引物和锚定引物组合做PCR扩增,共获得差别条带19条,其中只在SA诱导处理后出现的特异带15条,在未诱导对照中出现差异带4条,这些带可能与诱导处理屏蔽了某些基因的表达有关。对8条差异片段进一步回收、克隆,用EcoRI/ HindIII双酶切和PCR扩增,检验克隆结果。3,利用BLAST软件在GENEBANK上进行同源性比较,碱基序列分析表明:cDNA3-4-1与拟南芥的热激转录因子hsf8基因（At1g12800）具有83%的核苷酸同源性。SA诱导了热激转录因子hsf8基因的大量表达,从而可能影响热激蛋白hsp70的表达,对维持蛋白质结构,稳定胞内环境具有积极作用。cDNA1-23-1发现一段TGACG序列,对PR-1基因上游调节序列的大量研究发现,拟南芥中存在一个SA可诱导的调节因子:一段保守序列TGACG,它是PR-1基因表达所必需的。TGA蛋白属于植物bZIP转录因子,它既可以结合到其下游PR-1启动子的TGACG序列上,也可以与其上游的NPR1结合,从而为NPR1和PR-1基因表达之间提供直接连接。其它克隆的6条片段未显示与已知的病程相关基因或其他逆境胁迫相关基因有较高的同源性。对于这些片段是否为阳性需要进一步做Northern杂交,其中的阳性片段可以通过RACE技术获得与水杨酸诱导有关的新的基因全长。

论文目录

• 中文摘要
• SUMMARY
• 缩写词表
• 第一章 文献综述
• 1 植物体内水杨酸的合成与代谢
• 2 水杨酸在诱导系统获得抗性中的信号传导作用
• 3 水杨酸诱导植物的抗性
• 3.1 水杨酸诱导的植物抗病性
• 3.2 水杨酸诱导植物对非生物胁迫的抗性
• 4 基因差别表达的研究进展及方法
• 4.1 基因差别表达的研究方法
• 4.2 转录水平的基因差别表达研究技术及其在植物上的应用
• 4.3 mRNA 差别显示技术在逆境胁迫、抗病虫害和诱导剂诱导等方面的应用
• 5 本研究的目的意义
• 第二章 试验材料与方法
• 1 材料
• 1.1 植物材料与菌株
• 1.2 试剂、培养基的配制
• 1.3 引物
• 1.4 主要实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 甜瓜叶片总RNA 的提取
• 2.3 引物的配制
• 2.4 合成cDNA 第一链
• 2.5 DDRT-PCR 扩增
• 2.6 PCR 扩增产物回收
• 2.7 回收的差异片段克隆
• 2.8 连接产物转化大肠杆菌
• 2.9 大肠杆菌中质粒DNA 的制备
• 2.10 重组质粒的筛选与鉴定
• 2.11 测序
• 2.12 克隆片断序列及结构分析
• 2.13 序列的同源性比较
• 第三章 实验结果与分析
• 1 RNA 的提取
• 2 DDRT-PCR 扩增
• 2.1 随机引物的筛选
• 2.2 退火温度的筛选
• 2.3 差异cDNA 片段的展示
• 3 差异带的回收及二次扩增
• 4 测序结果及分析
• 4.1 质粒DNA 提取和酶切检测插入片段
• 4.2 克隆片段测序
• 4.3 同源性分析
• 第四章 讨论
• 1 适用于甜瓜叶片总RNA 提取的方法
• 2 mRNA 差别显示方法的改进
• 3 部分差异片段与抗性相关基因的关系
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介