茶氨酸生物合成：基因工程菌构建及其诱导合成条件

论文摘要

茶氨酸（Theanine）不仅是茶叶中的特征氨基酸,而且是茶汤特殊风味和鲜爽味的主要成分,是评价高级绿茶的重要标志。同时,大量研究和临床试验表明茶氨酸具有促进大脑功能和神经的生长、抗肿瘤、降压安神等功效。居于以上特点,其制备研究在目前的茶学研究中逐渐成为一个热点。由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸,成本较高;化学合成茶氨酸工艺较复杂;组织培养合成茶氨酸产量低。开展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理论意义和实践价值。本论文将生物技术运用到天然产物制备技术中,开展了工程菌构建方面工作。本论文通过基因克隆技术构建了工程菌,优化了工程菌催化合成茶氨酸的条件,从而达到提高茶氨酸产量的目的。主要研究结果如下:1、以培养好的Escherichia coli DH5α（E.coli DH5α）菌液为模板进行PCR反应,将扩增出的γ-谷氨酰转肽酶基因片断和载体pUC19,相连接构建重组质粒pUC19-GGT,将重组质粒pUC19-GGT转化至E.coli DH5α中,构建工程菌。工程菌株经0.1 mM IPTG在32℃诱导后,经酶活性检测,工程菌株每克湿菌体的酶活达到0.236 U/mL左右,约是出发菌株E.coli DH5α的2.6倍。工程菌经32℃培养6 h左右,然后再加IPTG至0.1mM于32℃诱导表达4 h收集菌体。1mL反应体系（含0.35ML-谷氨酰胺、2.0 M盐酸乙胺、70 mg/mL菌体、pH 9.5）于30℃培养4h,茶氨酸的最大生成量为0.475g/L左右。2、以培养好的荧光假单胞的菌液为模板进行PCR反应,将扩增出的谷氨酰胺合成酶基因片断和载体pET32a,相连接构建重组质粒pET-GS,将重组质粒pET-GS转化至E.coli BL21中,构建工程菌。工程菌株经0.1 mM IPTG在28℃诱导后,经酶活性检测,工程菌株湿菌体的酶活达到41.70 U/mgprot左右,约是出发菌株E.coli BL21的126.5倍。3、本实验优化了工程菌pET-GS催化合成茶氨酸的反应条件,工程菌经32℃培养6 h左右,然后再加IPTG至0.1mM于28℃诱导表达4h收集菌体。1 mL反应体系（L-谷氨酸钠0.2 M,盐酸乙胺1.2 M,咪唑100 mM,MnCl25 mM,ATP 30 mM,菌体100 mg/mL,pH 9.5）,200 rpm,于30℃培养14 h,茶氨酸的最大生成量为6.2 g/L左右。

论文目录

• 英文缩略表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 茶氨酸
• 1.1.1 茶氨酸研究的历史与现状
• 1.1.2 茶氨酸的制备
• 1.1.3 茶氨酸分析测定及提取纯化
• 1.1.4 茶氨酸的发展前景
• 1.2 γ-谷氨酰转肽酶
• 1.2.1 γ-谷氨酰转肽酶的分布
• 1.2.2 γ-谷氨酰转肽酶的制备
• 1.2.3 γ-谷氨酰转肽酶的催化反应
• 1.2.4 γ-谷氨酰转肽酶活性的测定
• 1.2.5 γ-谷氨酰转肽酶的应用及发展前景
• 1.3 谷氨酰胺合成酶
• 1.3.1 谷氨酰胺合成酶的分布
• 1.3.2 谷氨酰胺合成酶的催化反应
• 1.3.3 谷氨酰胺合成酶的应用价值
• 第二章 实验设计方案
• 2.1 实验目的
• 2.2 实验主要内容
• 2.3 技术路线
• 2.3.1 γ-谷氨酰转肽酶基因的克隆与表达
• 2.3.2 谷氨酰胺合成酶基因的克隆与表达
• 2.3.3 工程菌pET-GS催化合成茶氨酸反应条件的优化
• 第三章 大肠杆菌DH5A中的谷氨酰转肽酶基因的克隆
• 3.1 材料与方法
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 引物的设计与合成
• 3.2.2 以菌液为模板进行PCR扩增
• 3.2.3 PCR产物的回收
• 3.2.4 目的片段和载体双酶切并进行产物回收及纯化
• 3.2.5 连接反应
• 3.2.6 DH5a感受态细胞的制备
• 3.2.7 连接产物转化感受态细胞
• 3.2.8 碱法小批量抽提质粒DNA[46]
• 3.2.9 核酸电泳
• 3.2.10 重组质粒pUG-GGT的双酶切验证
• 3.2.11 基因序列测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 谷氨酰转肽酶基因的PCR扩增
• 3.3.2 重组质粒pUC19-GGT的构建
• 3.3.3 重组质粒pUC19-GGT双酶切验证
• 3.3.4 序列测定
• 3.4 小结
• 第四章 Γ-谷氨酰转肽酶的诱导表达研究
• 4.1 材料和试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 工程菌生长曲线制作方法
• 4.2.2 不同诱导温度优化
• 4.2.3 不同养菌温度优化
• 4.2.4 不同诱导剂浓度优化
• 4.2.5 酶活检测
• 4.2.6 茶氨酸合成测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 工程菌生长曲线的制作
• 4.3.2 诱导温度优化结果
• 4.3.3 养菌温度优化结果
• 4.3.4 诱导剂浓度优化结果
• 4.3.5 酶活测定
• 4.3.6 茶氨酸合成测定
• 4.4 小结
• 第五章 荧光假单胞菌中的谷氨酰胺合成酶基因的克隆
• 5.1 材料与方法
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 溶菌酶法抽提基因组
• 5.2.2 引物的设计与合成
• 5.2.3 以菌液为摸板进行PCR扩增及产物回收
• 5.2.4 目的片断和载体双酶切
• 5.2.5 连接反应
• 5.2.6 BL21感受态细胞的制备
• 5.2.7 连接产物转化感受态细胞
• 5.2.8 重组质粒pET-GS的双酶切验证
• 5.2.9 重组质粒pET-GS的PCR验证
• 5.2.10 基因序列测定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 荧光假单胞菌基因组的抽提
• 5.3.2 谷氨酰胺合成酶基因的PCR扩增
• 5.3.3 重组质粒pET-GS的构建
• 5.3.4 重组质粒pET-GS的双酶切验证
• 5.3.5 基因序列测定
• 5.4 小结
• 第六章 谷氨酰胺合成酶的诱导表达研究
• 6.1 材料和试剂
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 工程菌生长曲线制作方法
• 6.2.2 表达产物SDS-PAGE分析
• 6.2.3 GS试剂盒测定GS转移酶活性
• 6.2.4 不同诱导剂浓度优化
• 6.2.5 不同养菌温度优化
• 6.2.6 不同诱导温度优化
• 6.2.7 酶活性检测
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 工程菌生长曲线制作
• 6.3.2 表达产物SDS-PAGE分析结果
• 6.3.3 不同诱导剂浓度优化结果
• 6.3.4 不同养菌温度优化实验结果
• 6.3.5 不同诱导温度优化实验结果
• 6.3.6 酶活性检测
• 6.4 小结
• 第七章 工程菌催化合成茶氨酸反应条件的优化
• 7.1 材料和试剂
• 7.2 实验方法
• 7.2.1 茶氨酸合成测定
• 7.2.2 pH对茶氨酸合成的影响
• 7.2.3 ATP浓度对茶氨酸合成的影响
• 7.2.4 缓冲液对茶氨酸合成的影响
• 7.2.5 底物浓度对茶氨酸合成的影响
• 7.2.6 反应时间对茶氨酸合成的影响
• 7.2.7 对照实验
• 7.3 实验结果
• 7.3.1 pH对茶氨酸合成的影响
• 7.3.2 ATP浓度对合成茶氨酸的影响
• 7.3.3 咪唑作为缓冲液的确定
• 7.3.4 底物浓度对合成茶氨酸的影响
• 7.3.5 反应时间对合成茶氨酸的影响
• 7.4 小结
• 第八章 讨论与总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文情况