山羊痘荧光抗体检测与PCR方法的建立

论文摘要

山羊痘（Goat pox,GP）是由羊痘病毒属（Capripoxvirus）山羊痘病毒（Goatpoxvirus,GPV）引起的一种高度接触性传染病。临床上以体温升高,全身皮肤、呼吸道和消化道黏膜出现痘疹为主要特征。本病在印度、孟加拉、中东以及非洲中北部地区呈地方性流行,对养羊业造成严重的危害和巨大经济损失。本病被世界动物卫生组织（OIE）列为A类重大传染病,我国也将其列为国家一类动物疫病。近年来,我国黑龙江、四川和云南等省份相继报道了山羊痘的发生与流行。2002年10月,本病在贵州省首次爆发,并波及了8个养羊较为集中的地区,发病率高达66.38%（2940/4429）,死亡率为42.06%（1863/4429）;2007年8月,贵州省某地区又一次爆发该病。为对山羊痘疑似病例作出确定性诊断,本研究开展了山羊痘血清学与分子生物学检测方法的研究,取得了以下研究成果:1.山羊痘荧光抗体试验的建立:采用饱和硫酸铵盐析法和Sephadex G-25层析法从兔抗GPV高免血清中提纯IgG,标记荧光素,制备了山羊痘直接荧光抗体,用于检测感染细胞中的GPV抗原。结果表明,该方法能检测出BHK-21感染细胞中的病毒抗原,荧光抗体的最适工作浓度确定为1:32,且这种荧光能够被山羊痘标准阳性血清特异性抑制。用制备的荧光抗体分别检测感染GPV标准弱毒株、疫苗株及贵州分离株的BHK-21细胞抹片和飞片,结果均为阳性,而正常细胞对照均为阴性。2.基于P32基因PCR方法的建立及其基因序列分析:参照GenBank已发表的GPV基因序列,针对P32基因设计与合成了1对特异性引物,成功地建立了针对P32基因的PCR方法。PCR产物的酶切结果证实该PCR方法具有较好的特异性;敏感性检测显示,其DNA模板最小检出量为19.06×103pg;利用该方法对贵州省临床痘疹样本进行现场检测,其阳性检出率为100%（10/10）。采用Gel Extract Kit试剂盒回收纯化P32基因,与pMD18-T克隆载体4℃连接过夜,转化至感受态细胞DH5α,经PCR和酶切鉴定后送往大连宝生物工程有限公司进行序列测定,结果表明上述4株毒株的P32基因序列与国内外羊痘毒株之间核苷酸的同源性为97.9%～100%,所推导氨基酸的同源性为96.2%～100%。3.基于ITR基因PCR方法的建立及其基因片段序列分析:针对GPV ITR基因设计与合成了1对特异性引物,成功地建立了针对ITR基因片段的PCR方法。经PCR产物的酶切分析证实,该PCR方法亦具有较高的特异性;敏感性检测显示,其DNA模板最小检出量为24.40pg;用该方法对贵州省临床痘疹样本进行现场检测,其阳性检出率亦均为100%（10/10）。回收ITR基因片段,与pMD18-T载体连接,转化至DH5α,经PCR和酶切鉴定后进行序列测定,结果表明上述4株毒株的ITR基因片段序列与国内外羊痘毒株之间核苷酸的同源性为98.2%～100%,所推导氨基酸的同源性为96.5%～100%。4.通过PCR的特异性与敏感性检测以及基因序列的同源性比较分析,结果表明,基于ITR基因建立的PCR方法在敏感性及其基因序列保守性上均优于针对P32基因建立的PCR方法,这为临床上山羊痘的确诊建立了一种快速、简单、特异、敏感的PCR方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验毒株、细胞及血清
• 1.1.2 菌体与载体
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要实验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 山羊痘荧光抗体试验的建立与应用
• 1.2.2 基于P32基因PCR方法的建立及其基因序列分析
• 1.2.3 基于ITR基因PCR方法的建立及其基因片段序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 山羊痘荧光抗体试验的建立与应用
• 2.1.1 兔抗GPV高免血清IgG的提纯及纯度鉴定
• 2.1.2 荧光抗体的制备与质量鉴定
• 2.1.3 荧光抗体效价与最适工作浓度测定
• 2.1.4 阳性血清对荧光抗体的封闭
• 2.1.5 荧光抗体的应用
• 2.2 基于P32基因PCR方法的建立及其基因序列分析
• 2.2.1 P32基因PCR方法的建立
• 2.2.2 P32基因的克隆与序列分析
• 2.3 基于ITR基因PCR方法的建立及其基因片段序列分析
• 2.3.1 ITR基因PCR方法的建立
• 2.3.2 ITR基因片段的克隆与序列分析
• 3 讨论
• 4 结语
• 文献综述--山羊痘研究概况
• 1 病原学
• 1.1 分类及形态
• 1.2 理化性质
• 1.3 病毒培养
• 1.4 病毒的纯化与抗原性
• 1.5 病毒基因组
• 2 流行病学
• 2.1 流行情况
• 2.2 流行特点
• 3 临床症状
• 3.1 典型症状
• 3.2 非典型症状
• 4 发病机理
• 5 病理变化
• 5.1 剖检变化
• 5.2 病理组织学变化
• 5.3 显微病理变化
• 6 诊断
• 6.1 临床诊断
• 6.2 病毒的分离培养
• 6.3 琼脂扩散试验
• 6.4 荧光抗体检测试验
• 6.5 反向间接血凝试验
• 6.6 病毒中和试验
• 6.7 Western印迹试验
• 6.8 ELISA试验
• 6.9 PCR检测方法
• 7 疫苗及免疫
• 8 防制措施
• 9 研究目的与意义
• 主要参考文献
• 附录一 参与发表文章情况
• 附录二 各种溶液、试剂及培养基的配制
• 附录三 本文用到的部分英文缩写及含义说明
• 致谢